材料和试剂

年轻花药（在小孢子阶段的百合芽通常从30至65毫米的芽长）
氯化锂（LiCl）（Merck KGaA，目录号：105679）
Tris-base（United States Biological，目录号：75825）
乙二胺四乙酸（EDTA）（United States Biological，目录号：15699）
十二烷基硫酸钠（SDS）（AppliChem，目录号：A2263）
异戊醇（J.T.Baker ，目录号：JT9038-1）
苯酚（pH4.0）（United States Biological，目录号：77510）
氯仿（Merck KGaA，目录号：102445）
去离子蒸馏水（ddH 2 O）
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
乙酸钠（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
异丙醇（Merck KGaA，目录号：107022）
75％乙醇（分析纯）
液氮
0.1％DEPC ddH 2 O（无RNase水）（参见配方）
提取缓冲液（参见配方）
3 M乙酸钠（见配方）
10 mM乙酸钠缓冲液（见配方）
4 M LiCl（参见配方）
75％乙醇（见配方）

设备

Scalpel
镊子（不锈钢，长度：11.5cm;尖端：0.1mm）
陶瓷砂浆和杵
1.5 ml Eppendorf
离心机（Eppendorf，型号：5424）
通风橱
高速真空（Savant Systems LLC，型号：SC110）

程序

微孢子收集
1. 将约25个年轻百合芽的花药（3.5cm）用手术刀在花药的边缘附近横向切片。
2. 将该局部流体（小孢子）收集在1.5ml Eppendorf中管中含有200μl10mM乙酸钠缓冲液（pH 5.2）切割位点使用镊子轻轻地挤出流体沿着花药的表面移动到切割侧
  
  视频1.分离微孢子
3. 以7,000rpm（4,600×g）离心5分钟
4. 倾析上清液，保存管中的沉淀（小孢子）用于RNA提取
RNA分离
1. 将含有小孢子丸的Eppendorf管浸泡在液氮中
2. 将冷冻的小孢子（0.2g）转移到研钵中，在液氮中研磨，并将样品研磨成粉末
3. 在通风橱工作。通过1ml混合物加入组织粉末的热（〜80℃）萃取缓冲液/苯酚（1:1）并连续研磨在液氮中的研钵
4. 熔化后，将样品混合物的溶液转移到1.5ml Eppendorf管中
5. 加入0.2ml氯仿/异戊醇（24：1，v/v） Eppendorf管，关闭盖子，并手动摇动管30天秒。
6. 在4℃下，以12,000rpm（13,500xg）离心样品5分钟。
7. 将上层溶液转移到新的Eppendorf管中，加入等体积的4M LiCl
8. 在-80℃下沉淀RNA 2小时或-20℃过夜（约16小时）（注1）。
9. 在4℃下以12,000rpm离心10分钟。
10. 倾析上清液。
11. 通过上下吹打数次，将RNA沉淀溶解在0.4ml无RNA酶的水中
12. 加入1/10体积（40μl）的3M乙酸钠（pH5.2）和1体积（0.4ml）异丙醇。
13. 在-80℃下沉淀RNA 2小时或-20℃过夜（约16小时）（注1）。
14. 在4℃下以12,000rpm离心5分钟。
15. 倾析上清液。
16. 用0.6〜1ml的75％乙醇通过上下吹打数次来洗涤沉淀物
17. 在4℃下以12,000rpm离心5分钟。
18. 倾析上清液。
19. 通过速度真空快速干燥RNA沉淀。
20. 用适量的无RNA酶的水（通常20μl或更少）溶解RNA，并在55-60℃孵育10分钟。
21. 将RNA样品储存在-80℃。

代表数据

图1.从具有不同长度的百合花蕾分离的小孢子中分离总RNA（20μg）。 1.34-36mm芽; 2. 44-46 mm芽，两者均处于小孢子阶段，3.60-65mm芽处于小孢子和成熟花粉之间的转变处。使总RNA变性，在甲醛 - 琼脂糖凝胶上分级并用溴化乙锭染色。

食谱

0.1％DEPC ddH 2 O（无RNase水）
将1ml DEPC加入到999ml ddH 2 O中，在37℃下混合1小时并高压灭菌。
撷取缓冲区 ; 100 ml 最终浓度。

4 M LiCl
5 ml
200 mM

1 M Tris-HCl（pH 8.0）
20ml
200 mM

0.5M EDTA
4 ml
5 mM

10％SDS
20ml
2％

DEPC
ddH2O
51 ml
3 M乙酸钠（pH 5.2）
将24.61g乙酸钠（MW = 82.03）加入100ml ddH 2 O中，将pH调节至5.2，并高压灭菌。
10mM乙酸钠缓冲液（pH5.2）将82.03mg乙酸钠（MW = 82.03）加入100ml ddH 2 O中，将pH调节至5.2，并高压灭菌。
4 M LiCl
将16.96g LiCl（MW = 42.39）加入到100ml ddH 2 O中并高压灭菌。
75％乙醇将789.5ml的95％乙醇加入到210.5ml ddH 2 O中

笔记

在-20℃下沉淀RNA过夜（约16小时）可以导致更好的总RNA产量。然而，如果不关心产量，大多数RNA可以在-20℃下沉淀2小时。

致谢

该协议是来自Verwoerd等人（1989）的协议的改编。我们非常感谢他们的贡献。

参考文献

Liu，M.C.，Yang，C.S.，Yeh，F.L.，Wei，C.H.，Jane，W.N.，Chung，M.C.and Wang，C.S。（2014）。一种新颖的百合花药特异性基因编码在花药发育过程中与外壁形成相关的粘附素样蛋白。/a> J Exp Bot 65（8）：2023-2037。
Verwoerd，T.C.，Dekker，B.M.and Hoekema，A。（1989）。快速分离植物RNA的小规模程序核酸 Acids Res 17（6）：2362.