材料与试剂

A. 小鼠交配和胚胎解剖

1. 培养皿（100 毫米）（BD Biosciences，目录号：351029 或类似的）
2. 35 mm 细胞培养皿（BD Biosciences，目录号：352096 或类似的）
3. 无菌一次性管（50 mL）（BD Biosciences，目录号：352070 或类似的）
4. 15 毫升试管
5. 老鼠
6. 纯乙醇（Sigma，目录号：493546）
7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，不含 Ca 2+和 Mg 2+ （Life Technologies，Gibco® ，目录号：10010）
8. 4% 多聚甲醛 (PFA)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
9. 70% 乙醇（见食谱）

B. 显微 CT 样品制备

1. 卢戈氏溶液（Sigma ，目录号：32922）
2. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
3. 带有造影剂的染色溶液（参见配方）

设备

1. 钝钳（FST 标准型钳或类似钳）
2. 细镊子（Dumont #5 或类似物）和剪刀（FST，目录号：14060-09 或类似物）
3. X 射线计算机显微断层扫描 Skyscan 1172（Bruker）
该仪器是台式 µCT，配备完全失真校正的 11 MP X 射线相机（12 位冷却 CCD 相机耦合到闪烁体）。 X 射线源为 20 – 100 kV，10 W，光斑尺寸 <5 µm。 0.8 µm 是最高分辨率（仅适用于小样品），25 µm 是较低的分辨率。最大物体尺寸为 50 毫米。 Skyscan 1172 配备三个滤波器位置（无、0.5 毫米铝或铝+铜）。

软件

1. DataViewer 1.5.4.6（布鲁克）
2. NRecon 1.4.4（布鲁克）
3. CTVox 3.3.0（布鲁克）

程序

A. 小鼠交配

1. 让老鼠保持 12:12 小时的光/暗循环，不受限制地获取食物和水。使用 2 – 4 个月大的动物进行交配。
2. 为了交配，下午 6 点后将一只雄性和两只雌性放入笼中。
3. 次日上午9点前，检查阴道栓塞形成情况：将雌性尾巴提起，用钝钳稍扩张阴道口，检查是否有白色团块。
4. 将堵塞检测日视为 E0.5 日。将交配的雌性与雄性分开安置。接下来几天与未交配的雌性重复交配程序。

B. 胚胎解剖

Zeeb 等人所述进行胚胎解剖。 (2012) 。
1. 在 E15.5 天，安乐死怀孕的女性。
2. 将鼠标放在仰卧位置，并在腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 在皮肤和腹腔上做一个 V 形切口，提起组织以暴露内脏。
4. 用里面的胚胎串识别 V 形子宫，在近端（宫颈）和远端（卵巢）端切割，然后用冰冷的 PBS 将子宫移到试管中。
5. 在冰上用 PBS 解剖培养皿中的胚胎。首先，将子宫切成含有单个胚胎的碎片。将每个胚胎放入装有 PBS 的 35 毫米培养皿中，取出子宫组织和卵黄囊。如果需要，保留卵黄囊膜用于基因分型。

C. 胚胎固定

1. 将单个胚胎放入含有 5 mL 4% PFA 的 15 mL 管中，并在 4°C 下孵育 24 小时。
2. 固定后，将胚胎保存在 PBS 中，温度为 4°C。如果需要，样品可以在 4°C 下保存数天。

D. 显微 CT 样品制备

1. 准备 20% Lugol 溶液 + 0.5% Tween-20 pH 7.3 的新鲜染色溶液。
2. 将样品保持在染色溶液中并持续轻轻搅拌。
3. 每天更换溶液，持续 10 天。

E. 显微CT采集

使用分辨率为 3 µm、0.4° 旋转步长、360° 扫描和 4× 帧平均的 0.5 mm Al 过滤器在 80 kV 下执行采集。

F. 显微CT图像重建

使用 NRecon 软件 (Bruker) 获得图像重建，具有适当的错位补偿、无平滑、5 环伪影减少和 30% 光束硬化校正。

数据分析

1. 在 DataViewer 软件中打开单个胚胎的数据集（图 1）。

图1。 DataViewer软件的屏幕截图。胚胎在三个平面的虚拟切片中可视化。

2. 通过沿 x 轴和 y 轴移动来选择平面。在我们的案例中，我们有兴趣对胚胎心脏进行形态分析，特别是测量心室壁和室间隔的宽度以及心包腔的面积。在所有分析的胚胎中都选择了同一平面，最能代表我们感兴趣的特征。
3. 通过右键单击以获取以 μm 为单位的长度来测量感兴趣的特征。
4. 要执行定性调查，可以使用 CTVox 软件（图 2 和视频 1）在 3D 中可视化数据集。

图 2. CTVox 软件的屏幕截图。 E15.5 胚胎在 3D 切片中可视化。

视频 1. 胚胎

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 70 mL 纯乙醇与 30 mL 水混合获得。

2. 带造影剂的染色液
通过制备含 0.5% Tween-20 的 20% Lugol 溶液并将 pH 值调节至 7.3，获得具有造影剂的染色溶液。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Astanina 等人，2022）。这项工作得到了 AIRC – Associazione Italiana Per la Ricerca sul Cancro（赠款 22910）、Regione Piemonte（赠款 A1907A，偏转）、Fondazione CRT、Ministero dell'Università e della Ricerca（PRIN 2017，赠款 2017237P5X）、FPRC 5xmille 2016 MIUR 的支持（生物膜）和 ERA-Net Transcan-2（授予 TRS-2018-00000689）给 FB 和 Ministero dell'Università。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准（协议批准号 864/2015-PR）。

参考

Astanina, E., Doronzo, G., Corà, D., Neri, F., Oliviero, S., Genova, T., Mussano, F., Middonti, E., Vallariello, E., Cencioni, C.,等人。 (2022)。 TFEB-TGIF1 轴调节小鼠心外膜细胞的 EMT 。 Nat Commun 13(1)：5191。
Degenhardt, K.、Wright, AC、Horng, D.、Padmanabhan, A. 和 Epstein, JA (2010)。通过显微 CT 和碘染色对小鼠胚胎心血管发育进行快速 3D 表型分析。 Circ Cardiovasc 成像3(3)：314-322。
Handschuh, S. 和 Glösmann, M. (2022)。使用 X 射线显微 CT 对小鼠胚胎进行表型分析。 Front Cell Dev Biol 10：949184。
Hsu, CW, Wong, L., Rasmussen, TL, Kalaga, S., McElwee, ML, Keith, LC, Bohat, R., Seavitt, JR, Beaudet, AL 和 Dickinson, ME (2016)。小鼠从植入后早期到出生后早期发育的三维显微 CT 成像。开发生物学419(2)：229-236。
Jamet, S., Ha, S., Ho, TH, Houghtaling, S., Timms, A., Yu, K., Paquette, A., Maga, AM, Greene, NDE 和 Beier, DR (2022)。精氨酸甲基转移酶 Carm1 是心脏发育所必需的。 G3（贝塞斯达） 12（8）。
Lesciotto, KM、Motch Perrine, SM、Kawasaki, M.、Stecko, T.、Ryan, TM、Kawasaki, K. 和 Richtsmeier, JT (2020)。磷钨酸增强显微 CT：胚胎和出生后早期小鼠的优化方案。开发动态249(4)：573-585。
Petrillo, S., Chiabrando, D., Genova, T., Fiorito, V., Ingoglia, G., Vinchi, F., Mussano, F., Carossa, S., Silengo, L., Altruda, F.,等。 (2018)。血红素在内皮细胞中的积累会通过触发细胞凋亡而损害血管生成。细胞死亡差异25(3)：573-588。
Wong, MD、Dorr, AE、Walls, JR、Lerch, JP 和 Henkelman, RM (2012)。基于显微 CT 的新型 3D 小鼠胚胎图谱。发展139(17)：3248-3256。
Wong, MD、Spring, S. 和 Henkelman, RM (2013)。使用显微 CT 和碘染色对胚胎表型进行组织结构稳定。 PLoS 一8(12)：e84321。
Zeeb, M.、Axnick, J.、Planas-Paz, L.、Hartmann, T.、Strilic, B. 和 Lammert, E.（2012 年）。离体培养的小鼠胚胎中血液和淋巴血管形成的药理学操作。 Nat Protoc 7(11)： 1970-1982。

背景

转基因小鼠模型已被广泛用于研究特定基因在心脏发育中的作用。从历史上看，为了分析功能获得和功能丧失模型中心脏形成的形态学缺陷，对福尔马林固定石蜡包埋的胚胎进行切片和逐节分析。 X 射线计算机显微断层扫描 (µCT) 是可视化心脏 3D 形态和执行形态分析的强大工具。 µCT 使用 X 射线创建物理对象的横截面，可用于重建 3D 模型，达到非常高的分辨率（<1 µm）。在这里，我们描述了一种将这种技术应用于生物样本的方法。我们的目的是研究发育中小鼠胚胎的心血管系统。这种方法克服了传统组织学的局限性，例如难以获得可比较的部分，尤其是在处理非常小和复杂的样本时。
对于胚胎的 µCT 分析，必须增加组织的对比度。为此，文献中描述了不同的方法和造影剂，协议中的差异很小。可用于此目的并经作者测试的主要试剂是碘溶液或磷钨酸 (PTA) （Wong 等人，2012 年和 2013 年；许等人，2016 年； Handschuh 和 Glösmann，2022）。四氧化锇也用作造影剂，但由于其高毒性，作者尚未对其进行测试。两种染色方法以前都用于研究心脏缺陷（Degenhardt 等人，2010 年；莱肖托等人，2020 年；杰梅特等人，2022）。根据我们的经验，使用 2 % – 5% PTA 溶液需要甲醇 (3% – 10%) 才能正确渗透组织。 PTA和甲醇的浓度可以根据样品的大小进行调整；例如，对于小小鼠胚胎 (E12.5)，3% 的甲醇就足够了；对于 E15.5 胚胎，5% 甲醇；对于大型小鼠胚胎 (E18.5)，需要 10% 的甲醇。我们成功地将这种方法用于 E13.5 小鼠胚胎的染色（Petrillo 等人，2018）。尽管 PTA 方法提供了出色的对比度，但由于 E13.5 之前的胚胎样本收缩，它可能会导致伪影。适用于 µCT 的物体最大尺寸为 50 mm；但是，增加样本量会降低分辨率。
相反，碘基染色在样本保存和软组织对比度方面提供了良好的平衡，尤其是对于较大的样本。在我们的实验中，在 E15.5 胚胎中，我们使用了20% Lugol 溶液和 0.5% Tween-20 。为保护矿物结构，可将 pH 值调整至 7.3。

材料与试剂

A. 小鼠交配和胚胎解剖

1. 培养皿（100 毫米）（BD Biosciences，目录号：351029 或类似的）
2. 35 mm 细胞培养皿（BD Biosciences，目录号：352096 或类似的）
3. 无菌一次性管（50 mL）（BD Biosciences，目录号：352070 或类似的）
4. 15 毫升试管
5. 老鼠
6. 纯乙醇（Sigma，目录号：493546）
7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，不含 Ca 2+和 Mg 2+ （Life Technologies，Gibco® ，目录号：10010）
8. 4% 多聚甲醛 (PFA)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
9. 70% 乙醇（见食谱）

B. 显微 CT 样品制备

1. 卢戈氏溶液（Sigma ，目录号：32922）
2. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
3. 带有造影剂的染色溶液（参见配方）

设备

1. 钝钳（FST 标准型钳或类似钳）
2. 细镊子（Dumont #5 或类似物）和剪刀（FST，目录号：14060-09 或类似物）
3. X 射线计算机显微断层扫描 Skyscan 1172（Bruker）
该仪器是台式 µCT，配备完全失真校正的 11 MP X 射线相机（12 位冷却 CCD 相机耦合到闪烁体）。 X 射线源为 20 – 100 kV，10 W，光斑尺寸 <5 µm。 0.8 µm 是最高分辨率（仅适用于小样品），25 µm 是较低的分辨率。最大物体尺寸为 50 毫米。 Skyscan 1172 配备三个滤波器位置（无、0.5 毫米铝或铝+铜）。

软件

1. DataViewer 1.5.4.6（布鲁克）
2. NRecon 1.4.4（布鲁克）
3. CTVox 3.3.0（布鲁克）

程序

A. 小鼠交配

1. 让老鼠保持 12:12 小时的光/暗循环，不受限制地获取食物和水。使用 2 – 4 个月大的动物进行交配。
2. 为了交配，下午 6 点后将一只雄性和两只雌性放入笼中。
3. 次日上午9点前，检查阴道栓塞形成情况：将雌性尾巴提起，用钝钳稍扩张阴道口，检查是否有白色团块。
4. 将堵塞检测日视为 E0.5 日。将交配的雌性与雄性分开安置。接下来几天与未交配的雌性重复交配程序。

B. 胚胎解剖

Zeeb 等人所述进行胚胎解剖。 (2012) 。
1. 在 E15.5 天，安乐死怀孕的女性。
2. 将鼠标放在仰卧位置，并在腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 在皮肤和腹腔上做一个 V 形切口，提起组织以暴露内脏。
4. 用里面的胚胎串识别 V 形子宫，在近端（宫颈）和远端（卵巢）端切割，然后用冰冷的 PBS 将子宫移到试管中。
5. 在冰上用 PBS 解剖培养皿中的胚胎。首先，将子宫切成含有单个胚胎的碎片。将每个胚胎放入装有 PBS 的 35 毫米培养皿中，取出子宫组织和卵黄囊。如果需要，保留卵黄囊膜用于基因分型。

C. 胚胎固定

1. 将单个胚胎放入含有 5 mL 4% PFA 的 15 mL 管中，并在 4°C 下孵育 24 小时。
2. 固定后，将胚胎保存在 PBS 中，温度为 4°C。如果需要，样品可以在 4°C 下保存数天。

D. 显微 CT 样品制备

1. 准备 20% Lugol 溶液 + 0.5% Tween-20 pH 7.3 的新鲜染色溶液。
2. 将样品保持在染色溶液中并持续轻轻搅拌。
3. 每天更换溶液，持续 10 天。

E. 显微CT采集

使用分辨率为 3 µm、0.4° 旋转步长、360° 扫描和 4× 帧平均的 0.5 mm Al 过滤器在 80 kV 下执行采集。

F. 显微CT图像重建

使用 NRecon 软件 (Bruker) 获得图像重建，具有适当的错位补偿、无平滑、5 环伪影减少和 30% 光束硬化校正。

数据分析

1. 在 DataViewer 软件中打开单个胚胎的数据集（图 1）。

图1。 DataViewer软件的屏幕截图。胚胎在三个平面的虚拟切片中可视化。

2. 通过沿 x 轴和 y 轴移动来选择平面。在我们的案例中，我们有兴趣对胚胎心脏进行形态分析，特别是测量心室壁和室间隔的宽度以及心包腔的面积。在所有分析的胚胎中都选择了同一平面，最能代表我们感兴趣的特征。
3. 通过右键单击以获取以 μm 为单位的长度来测量感兴趣的特征。
4. 要执行定性调查，可以使用 CTVox 软件（图 2 和视频 1）在 3D 中可视化数据集。

图 2. CTVox 软件的屏幕截图。 E15.5 胚胎在 3D 切片中可视化。

视频 1. 胚胎

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 70 mL 纯乙醇与 30 mL 水混合获得。

2. 带造影剂的染色液
通过制备含 0.5% Tween-20 的 20% Lugol 溶液并将 pH 值调节至 7.3，获得具有造影剂的染色溶液。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Astanina 等人，2022）。这项工作得到了 AIRC – Associazione Italiana Per la Ricerca sul Cancro（赠款 22910）、Regione Piemonte（赠款 A1907A，偏转）、Fondazione CRT、Ministero dell'Università e della Ricerca（PRIN 2017，赠款 2017237P5X）、FPRC 5xmille 2016 MIUR 的支持（生物膜）和 ERA-Net Transcan-2（授予 TRS-2018-00000689）给 FB 和 Ministero dell'Università。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准（协议批准号 864/2015-PR）。

参考

Astanina, E., Doronzo, G., Corà, D., Neri, F., Oliviero, S., Genova, T., Mussano, F., Middonti, E., Vallariello, E., Cencioni, C.,等人。 (2022)。 TFEB-TGIF1 轴调节小鼠心外膜细胞的 EMT 。 Nat Commun 13(1)：5191。
Degenhardt, K.、Wright, AC、Horng, D.、Padmanabhan, A. 和 Epstein, JA (2010)。通过显微 CT 和碘染色对小鼠胚胎心血管发育进行快速 3D 表型分析。 Circ Cardiovasc 成像3(3)：314-322。
Handschuh, S. 和 Glösmann, M. (2022)。使用 X 射线显微 CT 对小鼠胚胎进行表型分析。 Front Cell Dev Biol 10：949184。
Hsu, CW, Wong, L., Rasmussen, TL, Kalaga, S., McElwee, ML, Keith, LC, Bohat, R., Seavitt, JR, Beaudet, AL 和 Dickinson, ME (2016)。小鼠从植入后早期到出生后早期发育的三维显微 CT 成像。开发生物学419(2)：229-236。
Jamet, S., Ha, S., Ho, TH, Houghtaling, S., Timms, A., Yu, K., Paquette, A., Maga, AM, Greene, NDE 和 Beier, DR (2022)。精氨酸甲基转移酶 Carm1 是心脏发育所必需的。 G3（贝塞斯达） 12（8）。
Lesciotto, KM、Motch Perrine, SM、Kawasaki, M.、Stecko, T.、Ryan, TM、Kawasaki, K. 和 Richtsmeier, JT (2020)。磷钨酸增强显微 CT：胚胎和出生后早期小鼠的优化方案。开发动态249(4)：573-585。
Petrillo, S., Chiabrando, D., Genova, T., Fiorito, V., Ingoglia, G., Vinchi, F., Mussano, F., Carossa, S., Silengo, L., Altruda, F.,等。 (2018)。血红素在内皮细胞中的积累会通过触发细胞凋亡而损害血管生成。细胞死亡差异25(3)：573-588。
Wong, MD、Dorr, AE、Walls, JR、Lerch, JP 和 Henkelman, RM (2012)。基于显微 CT 的新型 3D 小鼠胚胎图谱。发展139(17)：3248-3256。
Wong, MD、Spring, S. 和 Henkelman, RM (2013)。使用显微 CT 和碘染色对胚胎表型进行组织结构稳定。 PLoS 一8(12)：e84321。
Zeeb, M.、Axnick, J.、Planas-Paz, L.、Hartmann, T.、Strilic, B. 和 Lammert, E.（2012 年）。离体培养的小鼠胚胎中血液和淋巴血管形成的药理学操作。 Nat Protoc 7(11)： 1970-1982。

背景

转基因小鼠模型已被广泛用于研究特定基因在心脏发育中的作用。从历史上看，为了分析功能获得和功能丧失模型中心脏形成的形态学缺陷，对福尔马林固定石蜡包埋的胚胎进行切片和逐节分析。 X 射线计算机显微断层扫描 (µCT) 是可视化心脏 3D 形态和执行形态分析的强大工具。 µCT 使用 X 射线创建物理对象的横截面，可用于重建 3D 模型，达到非常高的分辨率（<1 µm）。在这里，我们描述了一种将这种技术应用于生物样本的方法。我们的目的是研究发育中小鼠胚胎的心血管系统。这种方法克服了传统组织学的局限性，例如难以获得可比较的部分，尤其是在处理非常小和复杂的样本时。
对于胚胎的 µCT 分析，必须增加组织的对比度。为此，文献中描述了不同的方法和造影剂，协议中的差异很小。可用于此目的并经作者测试的主要试剂是碘溶液或磷钨酸 (PTA) （Wong 等人，2012 年和 2013 年；许等人，2016 年； Handschuh 和 Glösmann，2022）。四氧化锇也用作造影剂，但由于其高毒性，作者尚未对其进行测试。两种染色方法以前都用于研究心脏缺陷（Degenhardt 等人，2010 年；莱肖托等人，2020 年；杰梅特等人，2022）。根据我们的经验，使用 2 % – 5% PTA 溶液需要甲醇 (3% – 10%) 才能正确渗透组织。 PTA和甲醇的浓度可以根据样品的大小进行调整；例如，对于小小鼠胚胎 (E12.5)，3% 的甲醇就足够了；对于 E15.5 胚胎，5% 甲醇；对于大型小鼠胚胎 (E18.5)，需要 10% 的甲醇。我们成功地将这种方法用于 E13.5 小鼠胚胎的染色（Petrillo 等人，2018）。尽管 PTA 方法提供了出色的对比度，但由于 E13.5 之前的胚胎样本收缩，它可能会导致伪影。适用于 µCT 的物体最大尺寸为 50 mm；但是，增加样本量会降低分辨率。
相反，碘基染色在样本保存和软组织对比度方面提供了良好的平衡，尤其是对于较大的样本。在我们的实验中，在 E15.5 胚胎中，我们使用了20% Lugol 溶液和 0.5% Tween-20 。为保护矿物结构，可将 pH 值调整至 7.3。

材料与试剂

A. 小鼠交配和胚胎解剖

1. 培养皿（100 毫米）（BD Biosciences，目录号：351029 或类似的）
2. 35 mm 细胞培养皿（BD Biosciences，目录号：352096 或类似的）
3. 无菌一次性管（50 mL）（BD Biosciences，目录号：352070 或类似的）
4. 15 毫升试管
5. 老鼠
6. 纯乙醇（Sigma，目录号：493546）
7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，不含 Ca 2+和 Mg 2+ （Life Technologies，Gibco® ，目录号：10010）
8. 4% 多聚甲醛 (PFA)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
9. 70% 乙醇（见食谱）

B. 显微 CT 样品制备

1. 卢戈氏溶液（Sigma ，目录号：32922）
2. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
3. 带有造影剂的染色溶液（参见配方）

设备

1. 钝钳（FST 标准型钳或类似钳）
2. 细镊子（Dumont #5 或类似物）和剪刀（FST，目录号：14060-09 或类似物）
3. X 射线计算机显微断层扫描 Skyscan 1172（Bruker）
该仪器是台式 µCT，配备完全失真校正的 11 MP X 射线相机（12 位冷却 CCD 相机耦合到闪烁体）。 X 射线源为 20 – 100 kV，10 W，光斑尺寸 <5 µm。 0.8 µm 是最高分辨率（仅适用于小样品），25 µm 是较低的分辨率。最大物体尺寸为 50 毫米。 Skyscan 1172 配备三个滤波器位置（无、0.5 毫米铝或铝+铜）。

软件

1. DataViewer 1.5.4.6（布鲁克）
2. NRecon 1.4.4（布鲁克）
3. CTVox 3.3.0（布鲁克）

程序

A. 小鼠交配

1. 让老鼠保持 12:12 小时的光/暗循环，不受限制地获取食物和水。使用 2 – 4 个月大的动物进行交配。
2. 为了交配，下午 6 点后将一只雄性和两只雌性放入笼中。
3. 次日上午9点前，检查阴道栓塞形成情况：将雌性尾巴提起，用钝钳稍扩张阴道口，检查是否有白色团块。
4. 将堵塞检测日视为 E0.5 日。将交配的雌性与雄性分开安置。接下来几天与未交配的雌性重复交配程序。

B. 胚胎解剖

Zeeb 等人所述进行胚胎解剖。 (2012) 。
1. 在 E15.5 天，安乐死怀孕的女性。
2. 将鼠标放在仰卧位置，并在腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 在皮肤和腹腔上做一个 V 形切口，提起组织以暴露内脏。
4. 用里面的胚胎串识别 V 形子宫，在近端（宫颈）和远端（卵巢）端切割，然后用冰冷的 PBS 将子宫移到试管中。
5. 在冰上用 PBS 解剖培养皿中的胚胎。首先，将子宫切成含有单个胚胎的碎片。将每个胚胎放入装有 PBS 的 35 毫米培养皿中，取出子宫组织和卵黄囊。如果需要，保留卵黄囊膜用于基因分型。

C. 胚胎固定

1. 将单个胚胎放入含有 5 mL 4% PFA 的 15 mL 管中，并在 4°C 下孵育 24 小时。
2. 固定后，将胚胎保存在 PBS 中，温度为 4°C。如果需要，样品可以在 4°C 下保存数天。

D. 显微 CT 样品制备

1. 准备 20% Lugol 溶液 + 0.5% Tween-20 pH 7.3 的新鲜染色溶液。
2. 将样品保持在染色溶液中并持续轻轻搅拌。
3. 每天更换溶液，持续 10 天。

E. 显微CT采集

使用分辨率为 3 µm、0.4° 旋转步长、360° 扫描和 4× 帧平均的 0.5 mm Al 过滤器在 80 kV 下执行采集。

F. 显微CT图像重建

使用 NRecon 软件 (Bruker) 获得图像重建，具有适当的错位补偿、无平滑、5 环伪影减少和 30% 光束硬化校正。

数据分析

1. 在 DataViewer 软件中打开单个胚胎的数据集（图 1）。

图1。 DataViewer软件的屏幕截图。胚胎在三个平面的虚拟切片中可视化。

2. 通过沿 x 轴和 y 轴移动来选择平面。在我们的案例中，我们有兴趣对胚胎心脏进行形态分析，特别是测量心室壁和室间隔的宽度以及心包腔的面积。在所有分析的胚胎中都选择了同一平面，最能代表我们感兴趣的特征。
3. 通过右键单击以获取以 μm 为单位的长度来测量感兴趣的特征。
4. 要执行定性调查，可以使用 CTVox 软件（图 2 和视频 1）在 3D 中可视化数据集。

图 2. CTVox 软件的屏幕截图。 E15.5 胚胎在 3D 切片中可视化。

视频 1. 胚胎

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 70 mL 纯乙醇与 30 mL 水混合获得。

2. 带造影剂的染色液
通过制备含 0.5% Tween-20 的 20% Lugol 溶液并将 pH 值调节至 7.3，获得具有造影剂的染色溶液。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Astanina 等人，2022）。这项工作得到了 AIRC – Associazione Italiana Per la Ricerca sul Cancro（赠款 22910）、Regione Piemonte（赠款 A1907A，偏转）、Fondazione CRT、Ministero dell'Università e della Ricerca（PRIN 2017，赠款 2017237P5X）、FPRC 5xmille 2016 MIUR 的支持（生物膜）和 ERA-Net Transcan-2（授予 TRS-2018-00000689）给 FB 和 Ministero dell'Università。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准（协议批准号 864/2015-PR）。

参考

Astanina, E., Doronzo, G., Corà, D., Neri, F., Oliviero, S., Genova, T., Mussano, F., Middonti, E., Vallariello, E., Cencioni, C.,等人。 (2022)。 TFEB-TGIF1 轴调节小鼠心外膜细胞的 EMT 。 Nat Commun 13(1)：5191。
Degenhardt, K.、Wright, AC、Horng, D.、Padmanabhan, A. 和 Epstein, JA (2010)。通过显微 CT 和碘染色对小鼠胚胎心血管发育进行快速 3D 表型分析。 Circ Cardiovasc 成像3(3)：314-322。
Handschuh, S. 和 Glösmann, M. (2022)。使用 X 射线显微 CT 对小鼠胚胎进行表型分析。 Front Cell Dev Biol 10：949184。
Hsu, CW, Wong, L., Rasmussen, TL, Kalaga, S., McElwee, ML, Keith, LC, Bohat, R., Seavitt, JR, Beaudet, AL 和 Dickinson, ME (2016)。小鼠从植入后早期到出生后早期发育的三维显微 CT 成像。开发生物学419(2)：229-236。
Jamet, S., Ha, S., Ho, TH, Houghtaling, S., Timms, A., Yu, K., Paquette, A., Maga, AM, Greene, NDE 和 Beier, DR (2022)。精氨酸甲基转移酶 Carm1 是心脏发育所必需的。 G3（贝塞斯达） 12（8）。
Lesciotto, KM、Motch Perrine, SM、Kawasaki, M.、Stecko, T.、Ryan, TM、Kawasaki, K. 和 Richtsmeier, JT (2020)。磷钨酸增强显微 CT：胚胎和出生后早期小鼠的优化方案。开发动态249(4)：573-585。
Petrillo, S., Chiabrando, D., Genova, T., Fiorito, V., Ingoglia, G., Vinchi, F., Mussano, F., Carossa, S., Silengo, L., Altruda, F.,等。 (2018)。血红素在内皮细胞中的积累会通过触发细胞凋亡而损害血管生成。细胞死亡差异25(3)：573-588。
Wong, MD、Dorr, AE、Walls, JR、Lerch, JP 和 Henkelman, RM (2012)。基于显微 CT 的新型 3D 小鼠胚胎图谱。发展139(17)：3248-3256。
Wong, MD、Spring, S. 和 Henkelman, RM (2013)。使用显微 CT 和碘染色对胚胎表型进行组织结构稳定。 PLoS 一8(12)：e84321。
Zeeb, M.、Axnick, J.、Planas-Paz, L.、Hartmann, T.、Strilic, B. 和 Lammert, E.（2012 年）。离体培养的小鼠胚胎中血液和淋巴血管形成的药理学操作。 Nat Protoc 7(11)： 1970-1982。

背景

转基因小鼠模型已被广泛用于研究特定基因在心脏发育中的作用。从历史上看，为了分析功能获得和功能丧失模型中心脏形成的形态学缺陷，对福尔马林固定石蜡包埋的胚胎进行切片和逐节分析。 X 射线计算机显微断层扫描 (µCT) 是可视化心脏 3D 形态和执行形态分析的强大工具。 µCT 使用 X 射线创建物理对象的横截面，可用于重建 3D 模型，达到非常高的分辨率（<1 µm）。在这里，我们描述了一种将这种技术应用于生物样本的方法。我们的目的是研究发育中小鼠胚胎的心血管系统。这种方法克服了传统组织学的局限性，例如难以获得可比较的部分，尤其是在处理非常小和复杂的样本时。
对于胚胎的 µCT 分析，必须增加组织的对比度。为此，文献中描述了不同的方法和造影剂，协议中的差异很小。可用于此目的并经作者测试的主要试剂是碘溶液或磷钨酸 (PTA) （Wong 等人，2012 年和 2013 年；许等人，2016 年； Handschuh 和 Glösmann，2022）。四氧化锇也用作造影剂，但由于其高毒性，作者尚未对其进行测试。两种染色方法以前都用于研究心脏缺陷（Degenhardt 等人，2010 年；莱肖托等人，2020 年；杰梅特等人，2022）。根据我们的经验，使用 2 % – 5% PTA 溶液需要甲醇 (3% – 10%) 才能正确渗透组织。 PTA和甲醇的浓度可以根据样品的大小进行调整；例如，对于小小鼠胚胎 (E12.5)，3% 的甲醇就足够了；对于 E15.5 胚胎，5% 甲醇；对于大型小鼠胚胎 (E18.5)，需要 10% 的甲醇。我们成功地将这种方法用于 E13.5 小鼠胚胎的染色（Petrillo 等人，2018）。尽管 PTA 方法提供了出色的对比度，但由于 E13.5 之前的胚胎样本收缩，它可能会导致伪影。适用于 µCT 的物体最大尺寸为 50 mm；但是，增加样本量会降低分辨率。
相反，碘基染色在样本保存和软组织对比度方面提供了良好的平衡，尤其是对于较大的样本。在我们的实验中，在 E15.5 胚胎中，我们使用了20% Lugol 溶液和 0.5% Tween-20 。为保护矿物结构，可将 pH 值调整至 7.3。

材料与试剂

A. 小鼠交配和胚胎解剖

1. 培养皿（100 毫米）（BD Biosciences，目录号：351029 或类似的）
2. 35 mm 细胞培养皿（BD Biosciences，目录号：352096 或类似的）
3. 无菌一次性管（50 mL）（BD Biosciences，目录号：352070 或类似的）
4. 15 毫升试管
5. 老鼠
6. 纯乙醇（Sigma，目录号：493546）
7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，不含 Ca 2+和 Mg 2+ （Life Technologies，Gibco® ，目录号：10010）
8. 4% 多聚甲醛 (PFA)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
9. 70% 乙醇（见食谱）

B. 显微 CT 样品制备

1. 卢戈氏溶液（Sigma ，目录号：32922）
2. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
3. 带有造影剂的染色溶液（参见配方）

设备

1. 钝钳（FST 标准型钳或类似钳）
2. 细镊子（Dumont #5 或类似物）和剪刀（FST，目录号：14060-09 或类似物）
3. X 射线计算机显微断层扫描 Skyscan 1172（Bruker）
该仪器是台式 µCT，配备完全失真校正的 11 MP X 射线相机（12 位冷却 CCD 相机耦合到闪烁体）。 X 射线源为 20 – 100 kV，10 W，光斑尺寸 <5 µm。 0.8 µm 是最高分辨率（仅适用于小样品），25 µm 是较低的分辨率。最大物体尺寸为 50 毫米。 Skyscan 1172 配备三个滤波器位置（无、0.5 毫米铝或铝+铜）。

软件

1. DataViewer 1.5.4.6（布鲁克）
2. NRecon 1.4.4（布鲁克）
3. CTVox 3.3.0（布鲁克）

程序

A. 小鼠交配

1. 让老鼠保持 12:12 小时的光/暗循环，不受限制地获取食物和水。使用 2 – 4 个月大的动物进行交配。
2. 为了交配，下午 6 点后将一只雄性和两只雌性放入笼中。
3. 次日上午9点前，检查阴道栓塞形成情况：将雌性尾巴提起，用钝钳稍扩张阴道口，检查是否有白色团块。
4. 将堵塞检测日视为 E0.5 日。将交配的雌性与雄性分开安置。接下来几天与未交配的雌性重复交配程序。

B. 胚胎解剖

Zeeb 等人所述进行胚胎解剖。 (2012) 。
1. 在 E15.5 天，安乐死怀孕的女性。
2. 将鼠标放在仰卧位置，并在腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 在皮肤和腹腔上做一个 V 形切口，提起组织以暴露内脏。
4. 用里面的胚胎串识别 V 形子宫，在近端（宫颈）和远端（卵巢）端切割，然后用冰冷的 PBS 将子宫移到试管中。
5. 在冰上用 PBS 解剖培养皿中的胚胎。首先，将子宫切成含有单个胚胎的碎片。将每个胚胎放入装有 PBS 的 35 毫米培养皿中，取出子宫组织和卵黄囊。如果需要，保留卵黄囊膜用于基因分型。

C. 胚胎固定

1. 将单个胚胎放入含有 5 mL 4% PFA 的 15 mL 管中，并在 4°C 下孵育 24 小时。
2. 固定后，将胚胎保存在 PBS 中，温度为 4°C。如果需要，样品可以在 4°C 下保存数天。

D. 显微 CT 样品制备

1. 准备 20% Lugol 溶液 + 0.5% Tween-20 pH 7.3 的新鲜染色溶液。
2. 将样品保持在染色溶液中并持续轻轻搅拌。
3. 每天更换溶液，持续 10 天。

E. 显微CT采集

使用分辨率为 3 µm、0.4° 旋转步长、360° 扫描和 4× 帧平均的 0.5 mm Al 过滤器在 80 kV 下执行采集。

F. 显微CT图像重建

使用 NRecon 软件 (Bruker) 获得图像重建，具有适当的错位补偿、无平滑、5 环伪影减少和 30% 光束硬化校正。

数据分析

1. 在 DataViewer 软件中打开单个胚胎的数据集（图 1）。

图1。 DataViewer软件的屏幕截图。胚胎在三个平面的虚拟切片中可视化。

2. 通过沿 x 轴和 y 轴移动来选择平面。在我们的案例中，我们有兴趣对胚胎心脏进行形态分析，特别是测量心室壁和室间隔的宽度以及心包腔的面积。在所有分析的胚胎中都选择了同一平面，最能代表我们感兴趣的特征。
3. 通过右键单击以获取以 μm 为单位的长度来测量感兴趣的特征。
4. 要执行定性调查，可以使用 CTVox 软件（图 2 和视频 1）在 3D 中可视化数据集。

图 2. CTVox 软件的屏幕截图。 E15.5 胚胎在 3D 切片中可视化。

视频 1. 胚胎

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 70 mL 纯乙醇与 30 mL 水混合获得。

2. 带造影剂的染色液
通过制备含 0.5% Tween-20 的 20% Lugol 溶液并将 pH 值调节至 7.3，获得具有造影剂的染色溶液。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Astanina 等人，2022）。这项工作得到了 AIRC – Associazione Italiana Per la Ricerca sul Cancro（赠款 22910）、Regione Piemonte（赠款 A1907A，偏转）、Fondazione CRT、Ministero dell'Università e della Ricerca（PRIN 2017，赠款 2017237P5X）、FPRC 5xmille 2016 MIUR 的支持（生物膜）和 ERA-Net Transcan-2（授予 TRS-2018-00000689）给 FB 和 Ministero dell'Università。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准（协议批准号 864/2015-PR）。

参考

Astanina, E., Doronzo, G., Corà, D., Neri, F., Oliviero, S., Genova, T., Mussano, F., Middonti, E., Vallariello, E., Cencioni, C.,等人。 (2022)。 TFEB-TGIF1 轴调节小鼠心外膜细胞的 EMT 。 Nat Commun 13(1)：5191。
Degenhardt, K.、Wright, AC、Horng, D.、Padmanabhan, A. 和 Epstein, JA (2010)。通过显微 CT 和碘染色对小鼠胚胎心血管发育进行快速 3D 表型分析。 Circ Cardiovasc 成像3(3)：314-322。
Handschuh, S. 和 Glösmann, M. (2022)。使用 X 射线显微 CT 对小鼠胚胎进行表型分析。 Front Cell Dev Biol 10：949184。
Hsu, CW, Wong, L., Rasmussen, TL, Kalaga, S., McElwee, ML, Keith, LC, Bohat, R., Seavitt, JR, Beaudet, AL 和 Dickinson, ME (2016)。小鼠从植入后早期到出生后早期发育的三维显微 CT 成像。开发生物学419(2)：229-236。
Jamet, S., Ha, S., Ho, TH, Houghtaling, S., Timms, A., Yu, K., Paquette, A., Maga, AM, Greene, NDE 和 Beier, DR (2022)。精氨酸甲基转移酶 Carm1 是心脏发育所必需的。 G3（贝塞斯达） 12（8）。
Lesciotto, KM、Motch Perrine, SM、Kawasaki, M.、Stecko, T.、Ryan, TM、Kawasaki, K. 和 Richtsmeier, JT (2020)。磷钨酸增强显微 CT：胚胎和出生后早期小鼠的优化方案。开发动态249(4)：573-585。
Petrillo, S., Chiabrando, D., Genova, T., Fiorito, V., Ingoglia, G., Vinchi, F., Mussano, F., Carossa, S., Silengo, L., Altruda, F.,等。 (2018)。血红素在内皮细胞中的积累会通过触发细胞凋亡而损害血管生成。细胞死亡差异25(3)：573-588。
Wong, MD、Dorr, AE、Walls, JR、Lerch, JP 和 Henkelman, RM (2012)。基于显微 CT 的新型 3D 小鼠胚胎图谱。发展139(17)：3248-3256。
Wong, MD、Spring, S. 和 Henkelman, RM (2013)。使用显微 CT 和碘染色对胚胎表型进行组织结构稳定。 PLoS 一8(12)：e84321。
Zeeb, M.、Axnick, J.、Planas-Paz, L.、Hartmann, T.、Strilic, B. 和 Lammert, E.（2012 年）。离体培养的小鼠胚胎中血液和淋巴血管形成的药理学操作。 Nat Protoc 7(11)： 1970-1982。

背景

转基因小鼠模型已被广泛用于研究特定基因在心脏发育中的作用。从历史上看，为了分析功能获得和功能丧失模型中心脏形成的形态学缺陷，对福尔马林固定石蜡包埋的胚胎进行切片和逐节分析。 X 射线计算机显微断层扫描 (µCT) 是可视化心脏 3D 形态和执行形态分析的强大工具。 µCT 使用 X 射线创建物理对象的横截面，可用于重建 3D 模型，达到非常高的分辨率（<1 µm）。在这里，我们描述了一种将这种技术应用于生物样本的方法。我们的目的是研究发育中小鼠胚胎的心血管系统。这种方法克服了传统组织学的局限性，例如难以获得可比较的部分，尤其是在处理非常小和复杂的样本时。
对于胚胎的 µCT 分析，必须增加组织的对比度。为此，文献中描述了不同的方法和造影剂，协议中的差异很小。可用于此目的并经作者测试的主要试剂是碘溶液或磷钨酸 (PTA) （Wong 等人，2012 年和 2013 年；许等人，2016 年； Handschuh 和 Glösmann，2022）。四氧化锇也用作造影剂，但由于其高毒性，作者尚未对其进行测试。两种染色方法以前都用于研究心脏缺陷（Degenhardt 等人，2010 年；莱肖托等人，2020 年；杰梅特等人，2022）。根据我们的经验，使用 2 % – 5% PTA 溶液需要甲醇 (3% – 10%) 才能正确渗透组织。 PTA和甲醇的浓度可以根据样品的大小进行调整；例如，对于小小鼠胚胎 (E12.5)，3% 的甲醇就足够了；对于 E15.5 胚胎，5% 甲醇；对于大型小鼠胚胎 (E18.5)，需要 10% 的甲醇。我们成功地将这种方法用于 E13.5 小鼠胚胎的染色（Petrillo 等人，2018）。尽管 PTA 方法提供了出色的对比度，但由于 E13.5 之前的胚胎样本收缩，它可能会导致伪影。适用于 µCT 的物体最大尺寸为 50 mm；但是，增加样本量会降低分辨率。
相反，碘基染色在样本保存和软组织对比度方面提供了良好的平衡，尤其是对于较大的样本。在我们的实验中，在 E15.5 胚胎中，我们使用了20% Lugol 溶液和 0.5% Tween-20 。为保护矿物结构，可将 pH 值调整至 7.3。

材料与试剂

A. 小鼠交配和胚胎解剖

1. 培养皿（100 毫米）（BD Biosciences，目录号：351029 或类似的）
2. 35 mm 细胞培养皿（BD Biosciences，目录号：352096 或类似的）
3. 无菌一次性管（50 mL）（BD Biosciences，目录号：352070 或类似的）
4. 15 毫升试管
5. 老鼠
6. 纯乙醇（Sigma，目录号：493546）
7. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，不含 Ca 2+和 Mg 2+ （Life Technologies，Gibco® ，目录号：10010）
8. 4% 多聚甲醛 (PFA)（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-281692）
9. 70% 乙醇（见食谱）

B. 显微 CT 样品制备

1. 卢戈氏溶液（Sigma ，目录号：32922）
2. Tween-20（Sigma，目录号：P1379）
3. 带有造影剂的染色溶液（参见配方）

设备

1. 钝钳（FST 标准型钳或类似钳）
2. 细镊子（Dumont #5 或类似物）和剪刀（FST，目录号：14060-09 或类似物）
3. X 射线计算机显微断层扫描 Skyscan 1172（Bruker）
该仪器是台式 µCT，配备完全失真校正的 11 MP X 射线相机（12 位冷却 CCD 相机耦合到闪烁体）。 X 射线源为 20 – 100 kV，10 W，光斑尺寸 <5 µm。 0.8 µm 是最高分辨率（仅适用于小样品），25 µm 是较低的分辨率。最大物体尺寸为 50 毫米。 Skyscan 1172 配备三个滤波器位置（无、0.5 毫米铝或铝+铜）。

软件

1. DataViewer 1.5.4.6（布鲁克）
2. NRecon 1.4.4（布鲁克）
3. CTVox 3.3.0（布鲁克）

程序

A. 小鼠交配

1. 让老鼠保持 12:12 小时的光/暗循环，不受限制地获取食物和水。使用 2 – 4 个月大的动物进行交配。
2. 为了交配，下午 6 点后将一只雄性和两只雌性放入笼中。
3. 次日上午9点前，检查阴道栓塞形成情况：将雌性尾巴提起，用钝钳稍扩张阴道口，检查是否有白色团块。
4. 将堵塞检测日视为 E0.5 日。将交配的雌性与雄性分开安置。接下来几天与未交配的雌性重复交配程序。

B. 胚胎解剖

Zeeb 等人所述进行胚胎解剖。 (2012) 。
1. 在 E15.5 天，安乐死怀孕的女性。
2. 将鼠标放在仰卧位置，并在腹部喷洒 70% 乙醇。
3. 在皮肤和腹腔上做一个 V 形切口，提起组织以暴露内脏。
4. 用里面的胚胎串识别 V 形子宫，在近端（宫颈）和远端（卵巢）端切割，然后用冰冷的 PBS 将子宫移到试管中。
5. 在冰上用 PBS 解剖培养皿中的胚胎。首先，将子宫切成含有单个胚胎的碎片。将每个胚胎放入装有 PBS 的 35 毫米培养皿中，取出子宫组织和卵黄囊。如果需要，保留卵黄囊膜用于基因分型。

C. 胚胎固定

1. 将单个胚胎放入含有 5 mL 4% PFA 的 15 mL 管中，并在 4°C 下孵育 24 小时。
2. 固定后，将胚胎保存在 PBS 中，温度为 4°C。如果需要，样品可以在 4°C 下保存数天。

D. 显微 CT 样品制备

1. 准备 20% Lugol 溶液 + 0.5% Tween-20 pH 7.3 的新鲜染色溶液。
2. 将样品保持在染色溶液中并持续轻轻搅拌。
3. 每天更换溶液，持续 10 天。

E. 显微CT采集

使用分辨率为 3 µm、0.4° 旋转步长、360° 扫描和 4× 帧平均的 0.5 mm Al 过滤器在 80 kV 下执行采集。

F. 显微CT图像重建

使用 NRecon 软件 (Bruker) 获得图像重建，具有适当的错位补偿、无平滑、5 环伪影减少和 30% 光束硬化校正。

数据分析

1. 在 DataViewer 软件中打开单个胚胎的数据集（图 1）。

图1。 DataViewer软件的屏幕截图。胚胎在三个平面的虚拟切片中可视化。

2. 通过沿 x 轴和 y 轴移动来选择平面。在我们的案例中，我们有兴趣对胚胎心脏进行形态分析，特别是测量心室壁和室间隔的宽度以及心包腔的面积。在所有分析的胚胎中都选择了同一平面，最能代表我们感兴趣的特征。
3. 通过右键单击以获取以 μm 为单位的长度来测量感兴趣的特征。
4. 要执行定性调查，可以使用 CTVox 软件（图 2 和视频 1）在 3D 中可视化数据集。

图 2. CTVox 软件的屏幕截图。 E15.5 胚胎在 3D 切片中可视化。

视频 1. 胚胎

食谱

1. 70% 乙醇
通过将 70 mL 纯乙醇与 30 mL 水混合获得。

2. 带造影剂的染色液
通过制备含 0.5% Tween-20 的 20% Lugol 溶液并将 pH 值调节至 7.3，获得具有造影剂的染色溶液。

致谢

该协议改编自先前发表的研究（Astanina 等人，2022）。这项工作得到了 AIRC – Associazione Italiana Per la Ricerca sul Cancro（赠款 22910）、Regione Piemonte（赠款 A1907A，偏转）、Fondazione CRT、Ministero dell'Università e della Ricerca（PRIN 2017，赠款 2017237P5X）、FPRC 5xmille 2016 MIUR 的支持（生物膜）和 ERA-Net Transcan-2（授予 TRS-2018-00000689）给 FB 和 Ministero dell'Università。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

所有动物程序均由都灵大学伦理委员会和意大利卫生部批准（协议批准号 864/2015-PR）。

参考

Astanina, E., Doronzo, G., Corà, D., Neri, F., Oliviero, S., Genova, T., Mussano, F., Middonti, E., Vallariello, E., Cencioni, C.,等人。 (2022)。 TFEB-TGIF1 轴调节小鼠心外膜细胞的 EMT 。 Nat Commun 13(1)：5191。
Degenhardt, K.、Wright, AC、Horng, D.、Padmanabhan, A. 和 Epstein, JA (2010)。通过显微 CT 和碘染色对小鼠胚胎心血管发育进行快速 3D 表型分析。 Circ Cardiovasc 成像3(3)：314-322。
Handschuh, S. 和 Glösmann, M. (2022)。使用 X 射线显微 CT 对小鼠胚胎进行表型分析。 Front Cell Dev Biol 10：949184。
Hsu, CW, Wong, L., Rasmussen, TL, Kalaga, S., McElwee, ML, Keith, LC, Bohat, R., Seavitt, JR, Beaudet, AL 和 Dickinson, ME (2016)。小鼠从植入后早期到出生后早期发育的三维显微 CT 成像。开发生物学419(2)：229-236。
Jamet, S., Ha, S., Ho, TH, Houghtaling, S., Timms, A., Yu, K., Paquette, A., Maga, AM, Greene, NDE 和 Beier, DR (2022)。精氨酸甲基转移酶 Carm1 是心脏发育所必需的。 G3（贝塞斯达） 12（8）。
Lesciotto, KM、Motch Perrine, SM、Kawasaki, M.、Stecko, T.、Ryan, TM、Kawasaki, K. 和 Richtsmeier, JT (2020)。磷钨酸增强显微 CT：胚胎和出生后早期小鼠的优化方案。开发动态249(4)：573-585。
Petrillo, S., Chiabrando, D., Genova, T., Fiorito, V., Ingoglia, G., Vinchi, F., Mussano, F., Carossa, S., Silengo, L., Altruda, F.,等。 (2018)。血红素在内皮细胞中的积累会通过触发细胞凋亡而损害血管生成。细胞死亡差异25(3)：573-588。
Wong, MD、Dorr, AE、Walls, JR、Lerch, JP 和 Henkelman, RM (2012)。基于显微 CT 的新型 3D 小鼠胚胎图谱。发展139(17)：3248-3256。
Wong, MD、Spring, S. 和 Henkelman, RM (2013)。使用显微 CT 和碘染色对胚胎表型进行组织结构稳定。 PLoS 一8(12)：e84321。
Zeeb, M.、Axnick, J.、Planas-Paz, L.、Hartmann, T.、Strilic, B. 和 Lammert, E.（2012 年）。离体培养的小鼠胚胎中血液和淋巴血管形成的药理学操作。 Nat Protoc 7(11)： 1970-1982。