材料和试剂

A. RNA提取

1. 均质器旋转柱（Thermo Fisher Scientific ，Life Technologies，目录号： 12183-026）

2. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，Aldrich Chemistry，目录号： M2650）

3. DNase I，扩增级（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号： 18068015)

4. 乙醇，分子级（Thermo Fisher Scientific，目录号： BP2818500）

5. PureLinkR RNA mini 试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，Life Technologies，目录号： 12183025）

6. RNase away（Thermo Fisher Scientific ，Life Technologies，目录号： 10328011 )

B. cDNA逆转录

1. MicroAmp 8管带（Thermo Fisher Scientific ，Applied Biosciences，目录号： A30589）

2. 高容量 cDNA 逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号： 4368814）

C. 多孔PCR反应

1. MicroAmp Optical 96孔反应板（Thermo Fisher Scientific ，Applied Biosystems，目录号： N8010560）

2. MicroAmp 光学胶膜（Thermo Fisher Scientific ，Applied Biosystems，目录号：4311971）

3. 无核酸酶水（US Biological LifeSciences，目录号： W0900）

4. PowerUp ^TMSYBR ^TMGreen master mix（Thermo Fisher Scientific ，Applied Biosystems，目录号： A25780）

D. 消耗品

1. 1.5 mL 和 0.6 mL 无 RNase 微量离心管

2. 无 RNase 过滤移液器吸头（P1000、P200、P20 和 P2）

E. 其他

1. 10 × PBS，分子级（Fisher Scientific，目录号：J75889K2

2. Accutase（Thermo Fisher Scientific，目录号：NC9464543）

3. 装有湿冰的桶

4. 个人防护装备（手套、实验室外套、护目镜）

设备

1. Revco Ultima II 超低温-86°C冰箱（Thermo Scientific，目录号：ULT2586-9）

2. 微量离心机5415C（Eppendorf，目录号： M7282）

3. 冷冻离心机（Beckman Coulter，目录号： GS6 Allegra）

4. 迷你离心机（Fisher Scientific，目录号： 05-090-100）

5. 水浴（Thermo Fisher Scientific，Cole Parmer，目录号：TSGP20）

6. MiniAmp ^TM热循环仪（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，目录号： A37834）

7. NanoDrop 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号： 13-400-525）

8. QuantStudio 6 Flex（Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific，目录号： 4485691）

9. 可选：PlateR 视觉移液辅助片剂（Biosistemika，目录号： P-10）

软件

1. 信标设计器（Premier Biosoft， http://www.premierbiosoft.com/qOligo/Oligo.jsp? PID=1 ）

2. 计算机 PCR 预测（UCSC 基因组浏览器， https: //genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr ）

3. Primer3 软件（怀特黑德生物医学研究所、Steve Rozen、Maido Remm、Triinu Koressaar 和 Helen Skaletsky， https: //bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ ）

4. QuantStudio Flex 6-v1.7.1（应用生物系统，ThermoFisher Scientific， https: //www.thermofisher.com/us/en/home/global/forms/life-science/quantstudio-6-7-flex-software.html ）

5. UNAFold（集成 DNA 技术， https: //www.idtdna.com/UNAFold ）。创建一个帐户以使用该软件

程序

A. Ngn2 引导的皮层神经元样本采集

根据 Wang等人的方案，以 1.5 × 10 ^{5 个细胞}接种的 iPSC 在12 孔板（每 cm ^{2约 40,000 个细胞）中分化}。 (2017) 使用 Ngn2 诱导细胞系。媒体每隔一天更换一次。如图 1 所示，分别在第 -3天（多西环素诱导前 3 天）、第 0 天、第 15 天和第 30 天收集 iPSC、前神经元、第 15 天和第 30 天皮质神经元的细胞，用于此 SYBR Green 多孔阵列的插图。 12 孔 iPSC 板的汇合孔可产生 3 × 10 ⁶-4 × 10 ^{6 个}细胞，RNA 产量约为 8-10 μg 总 RNA。对于前神经元，2 × 10 ⁶-3 × 10 ^{6 个细胞}的 RNA 产量范围为 5-6 μg ，对于神经元（第15 天和第 30 天），RNA 产量范围为 1 - 3 μg，从 1 × 10 ⁶-2 × 10 ^{6 个}细胞。

图 1 。 Ngn2 引导的皮层神经元分化和 RNA 提取样本收集的时间表。比例尺：100 μm。

1. 为分离细胞进行样本采集，吸出旧培养基，直接在 12 孔板的每孔中加入 400 μL Accutase，并在 37°C 下孵育细胞 3-5 分钟以将其提起。

2. 将 400 μL 的 1 ×冷 PBS 添加到 Accutase 中，上下移取细胞溶液以分离，并将细胞悬液转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。用额外的 400 μL 1 ×冷 PBS清洗井，以收集剩余的细胞并添加到同一 Eppendorf 管中。

3. ×离心细胞悬液 g在 4°C 下保持 5 分钟。

4. 吸出并丢弃上清液。

5. 用 1 mL 的 1 ×冷 PBS 上下吹打数次清洗细胞沉淀，并再次以 15,000 ×离心 g在 4°C 下保持 5 分钟。

6. 吸出上清液，同时保持在湿冰上。

7. 继续进行 RNA 提取或将细胞沉淀储存在 -80°C。

B. RNA 提取和纯化（PureLinkR RNA Mini Kit, Thermo Fisher, Life Technologies, 12183025）

准备：

1. 用 70% 乙醇和 RNase Away 清洁工作台。

2. 使用无 RNase 屏障过滤器吸头进行 RNA 提取。

3. 首次使用 Wash Buffer II 之前：

a. 将 60 mL 的 96-100% 乙醇直接添加到洗涤缓冲液瓶中。

b. 选中洗涤缓冲液 II 标签上的框以表明已添加乙醇。

c. 在室温下用乙醇储存洗涤缓冲液 II。

4. 为每次纯化制备含有 1% 2-巯基乙醇的新鲜裂解缓冲液。在化学罩下，每 300 μL 裂解缓冲液添加 3 μL 2-巯基乙醇。

程序：

1. 从 -80°C 冰箱中取出细胞沉淀并将其置于冰上（在室温下执行后续步骤）。

2. 向细胞沉淀中加入 300 μL 裂解缓冲液。

3. 高速涡旋 10 秒，直到细胞沉淀完全混合。

4. 将裂解物转移到插入无 RNase Eppendorf 管中的匀浆器离心柱中，并以 12,000 ×离心 g 2 分钟。离心后取出并丢弃均质器盒。

5. 在细胞匀浆中加入 300 μL 的 70% 乙醇。

6. 涡旋以彻底混合并分散加入乙醇后可能形成的任何可见沉淀物。

7. 将多达 700 μL 的样品转移到旋转墨盒（带有收集管）中。

8. 在室温下以 12,000 × g离心15 秒。丢弃流出液并将旋转筒重新插入同一收集管中。

9. 将 700 μL 的洗涤缓冲液 I 添加到旋转盒中。 12,000 ×离心机 g在室温下保持 15 秒。丢弃流通和收集管。将离心筒放入新的收集管中。

10. 将 500 μL 的洗涤缓冲液 II（辅以乙醇）添加到旋转筒中。

11. 12,000 ×离心机 g在室温下保持 15 秒。丢弃流出液并将旋转筒重新插入同一收集管中。

12. 重复步骤 10-11 一次。

13. ×离心离心柱 g 2 分钟以干燥含有 RNA 的膜。

14. 丢弃收集管并将离心筒插入新的回收管中。

15. 将 30 μL 的无 RNase 水添加到旋转墨盒的中心。

16. 在室温下孵育 1 分钟。

17. ×条件下将离心柱离心 2 分钟 g在室温下将 RNA 从膜上洗脱到回收管中。

18. 将洗脱的 RNA 样本再次添加到同一个离心柱中，并重复步骤 16-17 以增加 RNA 样本的产量。

19. 使用 NanoDrop 分光光度计测定洗脱 RNA 的浓度。

20. 如图 2 中所述，RNA 浓度因细胞类型而异。

21. 关键一步！将 RNA 分装到不含 RNase 的试管中，每个试管含有 1 μg RNA，以避免冻融循环和 RNA 降解。 1 μg RNA 的等分体积直接用于 DNase I 处理。

注意：等分试样在储存前用 DNase I 处理。

22. 在 RNA 纯化后直接进行 DNase I 处理或在 -80 °C 下冷冻等分试样。

23. 分装 RNA 和 cDNA 样品以避免冻融循环和样品降解是绝对关键的。

图 2. 不同细胞类型通过皮层神经元分化的工作流程和计算，具有停止点和存储。

C. DNase I Treatment （Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号： 18068015）

1. 将表 1 中所示的项目组合在无 RNase 管中：

表 1 。用于 DNase I 处理洗脱 RNA 的反应混合物

2. 混合并在室温下孵育 15 分钟。

3. 通过添加 1 热灭活 DNase I μL 25mM EDTA 加入经 DNase I 处理的 RNA 样品中，并将其置于 65°C 的水浴中 3 分钟。

4. 一旦 RNA 样品被 DNase I 热灭活，将它们放在冰上。

5. 继续进行逆转录或将等分试样储存在 -80°C。

D. cDNA逆转录（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit，Thermo Fisher，Invitrogen，目录号： 4368814）

将提取的 RNA 转化为 cDNA 用于 qPCR 扩增。作为对照，准备一个逆转录对照，在反应混合物中不添加逆转录酶。

根据表 2 制备反应混合物（RT 混合物）。将来自上一步的1 μg RNA（10 μL 体积）与反应混合物（表 2）混合，使 cDNA 的最终体积为 20 μL反应。

表 2。 用于 cDNA 逆转录反应的反应混合物。

1. cDNA RT反应的制备：

a. 准备好 RT 混合物，轻轻混合，然后放在冰上。

b. 移液器 10 µ L RT 预混液到 MicroAmp 8 管条中。

c. 将 10 μL 的 DNase I 处理的 RNA 样品 (1 μg ) 添加到反应混合物中，并通过上下吹打数次进行混合。

笔记：

i. 必须准备一个包含 RNA 输入但不包含 Multiscribe ^TM逆转录酶的试管。这用作逆转录酶对照 (RTC)，它可以确认没有基因组 DNA 被扩增。

ii. 移液时不要引入气泡。

d. 将试管密封并离心以降低内含物并消除气泡。

e. 将试管置于冰上并将它们装入 MiniAmp ^TM热循环仪。

2. 逆转录热循环条件（表 3）：

a. 反应体积设置为 20 µL 。

b. 将反应管装入热循环仪。

c. 热循环仪程序设置为 RUN。

d. 循环完成后，在 20 μL cDNA 中加入 80 μL 无核酸酶水，工作浓度为 10 ng/μL，将 cDNA 储存在 -80°C。

e. 关键一步！分装样品以避免冻融循环和 cDNA 降解。

表 3. cDNA 反应的热循环仪条件。

E. 引物设计

我们使用既定方案（Thornton 和 Basu，2011）设计了 SYBR Green 引物。本部分引物参数为：产物大小：80-120 bp，产物熔解温度（Tm）：63-66 ℃ ，二级结构ΔG ：不大于-3.5， GC百分比：35-80%，最优65%。引物以跨内含子的方式设计，因此正向和反向引物不在同一个外显子中。这可以避免基因组 DNA 的污染。

1. 步骤1：从美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站获取FASTA格式的目的基因序列： http ://www.ncbi.nlm.nih.gov 。

a. 从搜索“所有数据库”的下拉菜单中选择核苷酸选项。

b. 在搜索框中输入感兴趣的基因名称或序列 ID，然后单击搜索。

c. 由于皮质神经元与人类 iPSC 不同，要么在搜索栏中提及智人以及基因名称，要么在单击搜索后从网页左上角的物种过滤器中选择智人。

d. 单击 RefSeq 转录本并选择 FASTA 选项，然后单击应用。

2. 步骤2：获得所选基因的FASTA序列后，使用Primer3软件设计引物： https ://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ （圣卢西亚，1998 年），图 3 。

注意：默认值的解释在网页中给出： https ://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/input-help.htm 。

图 3 。 Primer3 网页截图显示了设计SYNAPSIN1 ( SYN1 ) 基因引物的参数和条件。

a. 将感兴趣的基因的 FASTA 格式序列复制并粘贴到 Primer3 引物设计页面上提供的框中。

b. 选择左侧引物：此选项留空，以便软件选择引物。

c. 挑选杂交探针：此选项留空。本实验不需要。

d. 选择正确的引物：如果此选项留空，Primer3 程序将选择正确的引物。

e. 序列 ID（基因名称）：这是为了识别序列的引物。对应于序列设置专有名称。

f. 目标（感兴趣基因的序列区域）：在查看 CDS 和外显子区域（如图 4 所示）后，针对目标输入序列中的特定核苷酸位置，然后是两侧的核苷酸数量围绕该特定区域设计的引物。图 4 显示了如何进入目标区域的示例。

图 4 。指示外显子位置的 NCBI 网页图像

g. 引物 Tm：这是 50% 的引物与 DNA 模板杂交的温度。对于本实验，所有引物均设计在 63-66°C Tm 范围内。

h. 最大 Tm 差值：输入值为 2。

i. 热力学参数表：Primer3 使用这些公式计算熔解温度。将方法设置为 SantaLucia (1998)。

j. 产物 Tm：这是 50% 的扩增子是 ssDNA 时的温度。将最佳值设置为 50。

k. Primer GC：这是允许的鸟嘌呤和胞嘧啶 (GC) 的最小和最大百分比。引物的GC含量用于确定引物的解链温度，可用于预测退火温度。将值设置为最小值：35，最佳值：65，最大值：80。

l. 最大自互补：引物不应自互补或相互互补。自互补引物形成自二聚体或发夹结构。输入值为 4。

m. 最大 3' 自互补：由于聚合酶在寡核苷酸的 3' 末端添加碱基，引物的 3' 末端不应相互互补，因为会产生引物二聚体。输入值为 3。

n. Max #N：这是 Primer3 在设计引物时可以考虑的最大未知碱基数。将值设置为 0。

o. Max Poly-X：引物中允许的最大单核苷酸重复数。长单核苷酸重复可以促进错误启动。输入值为 3。

p. 内部目标罚分和外部目标罚分：如果引物需要设计为与某个区域重叠，则使用此选项。保留为默认值。

q. First Base Index：此参数告诉 Primer3 输入序列中的第一个碱基是哪种编程索引类型。保留为默认值。

r. GC Clamp：定义左右引物 3' 端 Gs 和 Cs 的具体数量。将该值保留为 0。

s. 浓单价阳离子：这是 PCR 中 KCl 盐的毫摩尔浓度。输入值为 50 µM。

注意：根据 SantaLucia (1998)，假设一价阳离子的浓度为 50 μM，二价阳离子的浓度为 3.5 mM。其他文献表明单价阳离子的范围为 20 至 100 μM，二价阳离子的范围为 1.5 至 5 mM。

t. 盐校正公式：ΔG 和 Tm 等因素会影响 PCR 性能并改变引物对的效率。 Primer3 首选 SantaLucia (1998) 盐配方。该公式旨在适应与序列无关但取决于寡核苷酸长度的盐校正。

u. 浓二价阳离子的浓度：这是 PCR 混合物中存在的二价盐的浓度。将值设置为 3.5 毫米。

v. 浓dNTPs：通常建议使用 200 µM 的 dNTP 浓度，以便 Taq 聚合酶在常规 PCR 中有效发挥作用。一些 SYBR Green 预混液带有 Taq、KCl、MgCl ₂和 dNTP。这些在实验室中测试的混合物可提供最佳性能。输入值为 0.20 mM

w. 退火寡核苷酸浓度：用于计算寡核苷酸的熔解温度，这是 PCR 中退火寡核苷酸的纳摩尔浓度。保持默认。

x. 引物的目标函数惩罚权重：惩罚权重部分允许 Primer3 用户修改 Primer3 用于选择最佳引物组的标准。

引物的目标函数惩罚权重：

• Tm Lt = 1； Gt = 1

• 尺寸 Lt = 1； Gt =1

• 自互补 = 3

• 3' 自互补 = 3

• #N = 2

• 所有其他值 = 0

引物对的目标函数惩罚权重：

• 产品 Tm：Lt = 1； Gt = 1

• Tm 差异 = 2

• 任何互补 = 3

• 3' 互补 = 3

• Primer Penalty weight = 1

• 所有其他值 = 0

3. 分析引物：一旦所有的 Primer3 参数都设置好了，Primer3 就会设计引物对选项。

a. 输入所有选项后，按“Pick Primers”。

b. 序列将显示在引物下方，并显示生成引物的详细信息，引物在序列内的位置由正向引物 >>>>>>> 和反向引物 <<<<<< 指示.使用 Beacon Designer ^TM免费版分析具有正确产物长度和 Tm 的第一个引物的二级结构。根据3 '值选择引物对，不大于3.00。 3' 值是在引物对中形成的引物二聚体的测量值（图 5）。

图 5 。 Primer3 输出的图像，指示 3 ' 值，用于 SYN1 中的引物二聚体

4. 使用 Beacon Designer ^TM免费版检查引物二级结构。引物可接受的 ΔG 值不应超过 -3.5。

a. 访问http://free.premierbiosoft.com 。点击 Beacon Designer [免费版]。然后点击启动 Beacon Designer ^TM免费版。

b. 单击 SYBR Green 选项并在“感觉底漆”框中输入左侧底漆序列。在“反义引物”框中输入正确的引物序列。点击“分析”。

c. Beacon Designer 免费版允许您可视化可以在引物或引物对之间形成的二级结构。二级结构分析的示例如图 6 所示。

注意：如果无法避免自二聚体或交叉二聚体，请选择 -ΔG 最高的引物（即负数最小，最接近零的引物）。重新设计 ΔG 比 -3.5 kcal/mol 更负的引物。如果无法避免发夹，请避开涉及 3' 端的发夹，并使用 UNAFold 软件确定结构的熔化温度。

图 6 。 用于分析 SYN1 引物二级结构的 Beacon Designer 网页图像。

5. 使用 UNAFold 软件检查扩增子二级结构。

a. 一旦检查了引物的二级结构，就需要额外的 QC 步骤来使用 Integrated DNA Technologies (IDT) 的 UNAFold 软件验证扩增子的二级结构。

b. 访问： https ://www.idtdna.com/UNAFold 。将扩增子（包括正向和反向引物）复制到序列框中。将退火温度更改为 60°C，将镁浓度更改为 3 mM。点击提交。

c. 通过检查不应为 -3.5 的 ΔG 值来评估为扩增子显示的结构。

6. In-silico PCR ( https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr )：这是一个 QC 步骤，用于验证设计的正向和反向引物的外显子跨度，并交叉验证 Tm 和产物长度的引物组（图 7）。

a. 将每个基因的正向和反向引物插入空白处。

b. 将目标设置为显示 cDNA 序列的 GENCODE 也很重要，而基因组组装显示基因组 DNA 并允许验证内含子跨越引物序列。 https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQgenes.html#ens 。

c. 选择提交，以研究 in-silico PCR 的结果。

图 7 。 UCSC 浏览器中 SYN1 的 In-Silico PCR 分析和结果。

7. 所有引物均经过设计，并按 40 nmol 规模排序。引物原液在 100 µM 的无核酸酶水中重新配制，10 µM 的稀释液是工作浓度。

F. 测试引物效率

测试每个引物对的引物效率很重要，方法是创建一个标准曲线，其中包含 5 种 cDNA 模板的连续稀释度，例如1:5 稀释度。引物效率应介于 90-110% 之间。标准曲线应覆盖实验值的 Ct 值（图 8）。

1. 引物（正向和反向）浓度为 300 nM，cDNA 浓度设置为 5 倍连续稀释（12.5 ng、2.5 ng、0.5 ng、0.1 ng、0.02 ng），反应体积为5 µl ，一式三份一个 384 孔板。

2. https://toptipbio.com/calculate-primer-efficiencies/上提供的 Excel 模板计算引物效率 HYPERLINK "https://toptipbio.com/calculate-primer-efficiencies/" 。

图 8 。 Ngn2皮层神经元分化不同时间点相关基因的引物效率计算。

使用 iPS 细胞测试 OCT4 的效率。

G. 用于皮层神经元分化的多孔 SYBR Green qPCR 阵列的引物电镀

对于这个阵列，我们为 27 个基因和两个看家基因设计了 SYBR Green 引物。我们想要捕获多能性基因、神经前体基因和皮质神经元中上调的基因。我们还寻找突触标记和星形胶质细胞基因表达。我们在 96 孔光学板中对每个基因使用一式三份来研究每个基因的表达 (ΔΔCt) 以及阴性对照 (NC) 和逆转录酶对照 (RTC)。在无核酸酶水中稀释的引物的工作浓度为 10 μM。

1. 至少提前一天准备用于 PCR 运行的阵列，以便引物在一夜之间变干。

2. 根据 96 孔设计的板引物，一式三份（图 9）。预混合每个基因的正向和反向引物并添加到相应的孔中。步骤 3 中显示了要添加到每个孔中的引物量的计算。

图 9 。用于多孔 qPCR 反应的 96 孔板模板设计。

3. 引物体积：

a. 20 μL qPCR 反应体积中的引物浓度。

b. 96 孔板每孔 qPCR 反应的总反应量：20 µL 。

c. 底漆体积（来自 10 µM 工作溶液）：0.6 µL （正向底漆） +0.6 µL （反向底漆），每次反应达到 300 nM。

d. 总计：每孔每个基因 1.2 µL 预混合引物。

e. 每个基因一式三份制备引物混合物。引物混合物的量为 (0.6 μL + 0.6 μL) × 4 倍（包括 1 个额外的移液错误反应）。根据准备的盘子数量准备混合物。

可选：对于 96 或 384 孔板的电镀，可以使用 PlateR (Biosistemika) 促进移液，这是一种基于平板电脑的视觉支持，用于将样品移入孔中。

4. 关键。将底漆混合物分配在孔的底部并向下旋转板以使底漆混合物沉淀在孔的底部。

5. 让涂有底漆的板在室温下在特百惠容器中干燥过夜，以减少污染。

6. 时间考虑：单个 96 孔板的引物涂层大约需要 20-30 分钟。

注意：大批量优化后做阵列设计的底漆。板可以在室温下储存几个月，例如，在密封的塑料袋中。

7. 基于每个基因引物对的引物效率实验（在 384 孔板中进行），将引物和 cDNA 的浓度确定为 300 nM 和 2 ng（针对 96 孔计算）。

H. qPCR 分析（PowerUp ^TMSYBR ^TMGreen Master Mix [Thermo Fisher，目录号： A25780]）

PCR反应混合物：

1. 由于引物已经预涂在板上，因此只有 SYBR Green 预混液、cDNA 模板和无核酸酶水作为预混液混合并添加到每个孔中。由于预涂底漆会变干，因此预混液仅使用表 4 中所示的试剂制成，总体积为 20 μL。

2. 在加入板之前，将反应混合物彻底混合并向下旋转以避免气泡。加入反应混合物时，板应保持在冰上。计算 1-2 个额外反应以解决移液错误。对于 96 孔板反应，例如，准备 98 ×反应混合物（表 4）。

表 4 。多孔 Qpcr 的反应混合物。

3. 加入反应混合物后，用 MicroAmp 光学胶膜紧紧密封 96 孔板并短暂离心以去除任何气泡并将所有反应混合物带到孔底。

I. QuantStudio 6 Flex 中的板设置和软件链接

1. 板准备好进行 qPCR 运行后，打开 QuantStudio 软件 v1.7.1（软件部分中提到的链接）。

2. PCR 反应设置（引物 Tm 超过 60°C）：

a. 添加反应混合物后将板旋转下来，然后将其放入 QuantStudio 6 Flex。

b. 对于 63-66°C 之间的引物的 Tm，根据下表 5 设置热循环设置。退火温度应比 Tm 低约 3°C。

表 5 。 PCR 反应的热循环设置。

c. 仪器应设置为默认解离步骤，如表 6 所示。

表 6 。 解离步骤的设置。

d. 运行完成后，可以通过单击分析来分析 Ct 数据，并且可以通过单击 excel 表将数据导出为 excel 文件。

e. Quantstudio 6 中的印版设置如图 10 所示。有关详细的板设置、运行参数和分析，请遵循随附的 QuantStudio 软件用户指南： https ://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/4489822.pdf 。

图 10 。在 QuantStudio 6 Flex 软件中设置板的工作流程表示。

数据分析

对于数据分析，我们使用 QuantStudio 软件分析每个基因的 Ct 值和重复的变异性。可接受的循环差不应超过 0.5 个循环。管家基因 B-ACTIN 或 GAPDH 被用作比较第 0 天、第 15 天和第 30 天皮层神经元 Ct 值与 iPSCs Ct 值的基因的 ΔΔCt 计算 (Livak and Schmittgen, 2001) 的加载对照。负模板控制不应显示放大（Excel 中 ΔΔCt 计算的链接是https://1drv.ms/x/s!AgUabBW4Y2yQgZEon-ZKuwMJ4PhaLQ ）。

如表 7 所示，为了计算基因 2 ^-ΔΔCt倍数变化的平均值，我们最初将感兴趣基因的 Ct 与看家基因（对照）、B-ACTIN 和差异它们之间是ΔCt。接下来，要计算 ΔΔCt，取 iPSC 的 ΔCt 值的平均值。当我们从平均 (ΔCt) _iPSCs中减去每个样本的 ΔCt 值时，我们得到 ΔΔCt。使用 ΔΔCt 值，我们计算 2 ^-ΔΔCt和 2 -ΔΔCt 的^平均值。这显示了每个样本中基因表达相对于它们在 iPSC 中的表达的倍数变化。为了直观地说明基因表达的变化，我们使用 GraphPad Prism 绘制了不同时间点的样本热图。多能性标记 OCT4 和 NANOG 在iPSCs 中高度表达（图 10），表达急剧下降，在某些情况下，在皮层神经元分化的第 15 天和第 30 天检测不到。与 iPSC 相比，早期成熟的皮质、神经元和突触蛋白的标志物在第 15 天和第 30 天样本中的表达增加（图 11）。管家基因 B-ACTIN 和 GAPDH 都显示出相当的结果。

NANOG基因的 ΔΔCt 计算。

图 11 。使用 β-肌动蛋白作为管家基因的基因表达倍数变化比较 iPSC 与第 0 天、第 15 天和第 30 天皮质神经元 多能性标志物（OCT4 和 NANOG）、早期神经元标志物（SOX2 和 NESTIN）、成熟皮质神经元标志物（POU3F2 和 TBR1）和突触标志物（BASSOON 和 SYNAPSIN）。

摘要：

总之，我们为多功能多孔 SYBR Green qPCR 协议描述了一个全面且经济的协议。单管 SYBR Green qPCR 是许多实验室评估基因表达的标准程序，也有可用于 SYBR Green 阵列的商业平台。然而，我们的协议侧重于通过构建可定制并在室温下存储数月的多孔 qPCR 阵列来分析多个基因的有效方法。这些阵列非常适合监测 iPSC 分化为各种细胞类型的方案，并且这些阵列可以轻松定制。

致谢

该研究得到了加州再生医学研究所 (CIRM) 桥梁项目 (TB1-01195) 的支持。

利益争夺

没有什么可透露的。

伦理

这项工作在干细胞研究监督协议 SCRO-754 下获得批准，使用 WTC11 人类诱导的多能干细胞进行 Ngn2 分化。

参考文献

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