材料和试剂

60 mm组织培养皿（上海Sunub Bio-Tech Development Inc，目录号：TCD-60）
15 ml离心管（Corning Incorporated-Life Sciences，目录号：430791）
50 ml离心管（Corning Incorporated-Life Sciences，目录号：430829）
12孔培养集群（Corning Incorporated-Life Sciences，目录号：CLS3512-100EA）
25 × 75 mm 粘附显微镜载玻片（CITOTEST，CITOTEST ® ，目录号：188105）
24×50 mm显微镜盖玻璃（Titan，目录号：02036401）
泡沫板（15×10×4厘米）
针（上海仁慈集团，描述：0.45 mm × 16 mm RW LB）
铝箔（Top group，Miaojie，目录号：MF50）
黑色培养箱（海门科技实验设备，目录号：G1050）
小鼠：小鼠品系：C57BL/6J
小鼠胚胎（胚胎期，E16.5）
新生幼崽（产后第 1 天，P1）
成年小鼠（2 个月大，2M）
Triton X-100（上海世盛思巴斯科技发展有限公司，目录号：H2Q0212）
Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（上海实验试剂有限公司，目录号：174710）
KH 2 PO 4 （上海实验试剂有限公司，目录号：168130）
NaCl（国药集团化学试剂有限公司，目录号：10019318）
KCl（国药集团化学试剂有限公司，目录号：10016318）
液体阻滞剂超级纸笔（Daido Sangyo Co.，Ltd，目录号：Daido-Sangyo.SBM05480）
正常山羊血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，目录号：005-000-121）
一抗抗突触素（兔）（Thermo Fisher Scientific，目录号：PA1-1043）
α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-488（Alomone Labs，目录号：B-100-AG）
二抗Alexa Fluor TM 546山羊抗兔IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11035）
Fluoromount TM水性封固剂（Sigma-Aldrich，目录号：F4680-25ML）
10×PBS（见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
PBS 中的 0.5% Triton X-100（见配方）
0.1 M 甘氨酸（见食谱）
阻塞解决方案（见食谱）
一抗溶液（见配方）
二抗溶液（见配方）

设备

弯头眼钳（上海世盛思巴斯科技发展有限公司，目录号：D020102）
眼科剪刀（上海世盛思巴斯科技发展有限公司，目录号：D010101）
直钳（上海世盛思巴斯科技发展有限公司，目录号：433050）
箭钳（上海世盛思巴斯科技发展有限公司，目录号：433051）
蔡司共聚焦激光扫描显微镜（蔡司，型号：LSM880NLO FLIM）

软件

ZEN ( https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html )

程序

隔膜分离
胚胎隔膜 (E16.5) 分离（视频 1）
在 E16.5 阶段，通过颈椎脱位对怀孕的小鼠实施安乐死。
在鼠标上喷洒 75% 乙醇并将鼠标朝上放置。
用眼科剪刀沿中线快速剪开皮肤和肌肉，取出胚胎。
在 4°C 下用 4% PFA 整夜固定整个胚胎。
将胚胎放入 PBS 中，沿肋骨切开以去除下半身。然后沿着腋窝切开以去除上半身。
将肺、隔膜和肝脏与胸腔分开。小心地取出肺和肝脏。此步骤可确保隔膜的完整性。

视频 1. 从小鼠胚胎中分离隔膜

新生儿膈肌 (P1) 分离（视频 2）
通过二氧化碳吸入和斩首在 P1 处安乐死幼崽。
沿着肋骨切开以去除下半身。
使用眼科剪刀在隔膜和胸腔的交界处剪一个小开口。
用弯头眼钳和直钳小心地分离隔膜。
将隔膜放入 PBS 并将其压平。
从隔膜中取出其他组织。
用 4% PFA 固定隔膜。

视频 2. 分离新生幼崽的隔膜

成人横膈膜 (2M) 分离（视频 3）
通过颈椎脱位对成年小鼠实施安乐死。
在鼠标上喷洒 75% 乙醇并将鼠标朝上固定。
使用眼科剪刀沿中线快速切割皮肤和肌肉。
将其他组织与隔膜分开。
夹住隔膜的边缘, 用眼科剪刀沿它切割, 将其与其他组织分开。
将隔膜放入 PBS 并将其压平。
从隔膜中取出其他组织。
用 4% PFA 固定隔膜。

视频 3. 从成年小鼠中分离隔膜

横膈膜免疫荧光染色
胚胎/新生儿膈肌染色
在室温下用 4% PFA 将新生儿隔膜固定在 12 孔板中 1-2 小时（此步骤可以省略，因为胚胎隔膜是从用 4% PFA 在 4°C 下过夜固定的胚胎中分离出来的）。
用 PBS 清洗隔膜 3 次，每次 5-8 分钟，在室温下，并以 50-60 rpm 轻微摇晃。
在室温下用 0.1 M 甘氨酸清洗隔膜 1 小时，以 50-60 rpm 轻微晃动（长时间固定会增加固定诱导的自发荧光，0.1 M 甘氨酸可以减少自发荧光）。
用 PBS 清洗隔膜 3 次，每次 5-8 分钟，在室温下，并以 50-60 rpm 轻微摇晃。
在室温下用 0.5% Triton X-100 在 PBS 中渗透隔膜 1 小时，不要摇晃。此步骤对于以下封闭和染色程序尤其重要。
将隔膜转移到载玻片上，并用疏水笔在隔膜外侧画一个圆圈。然后，用 100 阻止它μl 在装有湿毛巾的黑色培养箱中 4°C 过夜封闭溶液（图 1）。

图 1. 胚胎/新生儿隔膜阻塞方法

去除封闭溶液并添加一抗溶液。在 4°C 的黑色湿培养箱中孵育过夜。
去除一抗溶液，并在室温下用 0.5% Triton X-100 在 PBS 中清洗隔膜 3 次，每次 1 小时。
使用在封闭溶液中稀释的 a-BTX 和荧光染料偶联的二抗在 4°C 下孵育过夜。
取出二抗溶液，在室温下用 0.5% Triton X-100 在 PBS 中清洗隔膜 3 次，每次 1 小时。
用 100 μl 安装介质安装隔膜，并用盖玻片覆盖。将其在 4°C 下过夜直至共聚焦成像。
成人膈肌染色
在铺有铝箔的泡沫板上开一个小孔（4×4×2cm），将振膜放入；用针将其固定到位，并在室温下用 4% PFA 固定 1-2 小时（图 2）。
注意：此步骤应在隔膜分离后立即执行。

图 2 成人横膈膜固定方法

用 PBS 清洗隔膜 3 次，每次 5-8 分钟，在室温下，并以 50-60 rpm 轻微摇晃。
在室温下用 0.1 M 甘氨酸清洗隔膜 1 小时，以 50-60 rpm 轻微摇晃。对于成人隔膜，在此步骤中用箭头钳小心去除覆盖其表面的结缔组织（图 3）。

图 3. 从成人隔膜中去除结缔组织。去除结缔组织的碎片用红色箭头表示。

用 PBS 清洗隔膜 3 次，每次 5-8 分钟，在室温下，并以 50-60 rpm 轻微摇晃。
在 4°C 下用 0.5% Triton X-100 在 PBS 中对隔膜进行通透，无需摇晃。
在室温下用 500 μl 封闭溶液在 12 孔板中进行封闭，无需摇动（图 4）。

图 4 成人横膈膜阻滞方法

其余染色程序与步骤 B1g 至 B1k，胚胎/新生儿染色相同。对于成人隔膜，继续将抗体溶液移至隔膜中间 5 分钟，让抗体渗透到隔膜中。然后，在 4°C 下孵育过夜。

数据分析

E16.5 隔膜 NMJ 染色的图像如图 5 所示。突触前神经末梢用抗突触素（SYN，红色）标记，突触后 AChR 用α-金环蛇毒素（α-BTX，绿色）标记。使用蔡司共聚焦激光扫描显微镜以 20 倍放大率拍摄图像。请注意，大多数神经末梢与胚胎 E16.5 隔膜中的 AChR 共定位。

图 5. E16.5 隔膜的 NMJ 免疫荧光染色。比例尺：20 μm。

食谱

10×PBS
对于 1 L 溶液，在 1 L ddH 2 O 中稀释 80 g NaCl、2 g KCl、35.8 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 和 2.4 g KH 2 PO 4。在室温下剧烈摇动直至完全溶解并在室温下储存。使用 1× PBS 时稀释 10 倍。
4% 多聚甲醛 (PFA)
在 10 ml 1× PBS 中稀释 0.4 g 多聚甲醛。将其置于 60°C 下 1-2 小时直至完全溶解，然后在使用前置于 4°C。4% PFA溶液应新鲜制备。
0.5% 海卫 X-100
将 2.5 ml 100% Triton X-100 与 500 ml 1× PBS 混合。在室温下剧烈摇晃直至完全溶解。
0.1 M甘氨酸
在 50 ml 1× PBS 中稀释 0.375 g 甘氨酸。在室温下剧烈摇晃直至完全溶解。
阻塞解决方案
5% 正常山羊血清 (NGS)。对于 5 ml 溶液，用 4.75 ml 0.5% Triton X-100 稀释 250 ul 100% NGS。移液器并混合均匀。
一抗溶液
在 100 μl 封闭液中稀释 1 μl 抗突触素抗体。
二抗溶液
在封闭溶液中稀释 α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-488 和山羊抗兔 IgG Alexa Fluor TM 546 偶联物。α-Bungarotoxin-ATTO Fluor-488 的最终稀释比为 1:100，山羊抗兔 IgG Alexa Fluor TM 546 偶联物的最终稀释比为 1:1,000。

致谢

这项工作得到了上海市科研项目（19JC1416000）、国家自然科学基金（31870819、31570818）的资助。该协议改编自 Liu等人。(2020)。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

Arimura, S., Okada, T., Tezuka, T., Chiyo, T., Kasahara, Y., Yoshimura, T., Motomura, M., Yoshida, N., Beeson, D., Takeda, S.等艾尔。(2014)。神经肌肉疾病。DOK7 基因疗法有益于以神经肌肉接头缺陷为特征的疾病小鼠模型。科学345（6203）：1505-1508。
Li, L., Xiong, WC 和 Mei, L. (2018)。神经肌肉接头的形成、衰老和疾病。Annu Rev Physiol 80：159-188。
Liu, W. 和 Chakkalakal, JV (2018)。神经肌肉接头的组成、发育和再生。Curr Top Dev Biol 126：99-124。
Liu, Y., Luo, Y., Shen, L., Guo, R., Zhan, Z., Yuan, N., Sha, R., Qian, W., Wang, Z., Xie, Z.,等人。(2020)。剪接因子 SRSF1 对小鼠神经肌肉接头的卫星细胞增殖和出生后成熟至关重要。干细胞报告15(4): 941-954。
Merrell, AJ 和 Kardon, G.（2013 年）。横膈膜的发育——哺乳动物呼吸所必需的骨骼肌。FEBS J 280(17): 4026-4035。

版权所有 © 2021 作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。 1