材料和试剂

一次性手术刀
300 -和 120 - µm 自制筛子
Ñ OTE：剪切50 -在约4毫升的塑料管-从开口5厘米。用铝箔盖住加热板。使用加热板将一块尼龙网（Sefar Nitex，目录号：03-300/51 [ 300 - µm 开口] 、03-120/49 [ 120 - µm 开口] ）与切割管融合。
15 - ml 玻璃离心管（Dutscher，目录号：092305）
15 - ml塑料锥形管（例如，Sarstedt，目录号：62.554.502）
60 - mm 塑料培养皿（例如，Sarstedt，目录号：82.1194.500）
92 - mm 塑料培养皿（例如，Sarstedt，目录号：82.1473.001）
60 -毫米和92 -毫米琼脂糖-涂覆的培养皿中。或者，可以像Sardet等人一样使用明胶涂层菜肴 (GF) 。( 2011)
Ñ OTE：熔体的在海水中的琼脂糖（每100ml海水1g）的。填充92 -毫米培养皿与热溶液。将琼脂糖溶液倒入下一道菜中，制作一层薄薄的琼脂糖层；重复，直到你有足够的菜肴（需要2种每电菜肴，加上dechorionation，施肥一打，洗荷兰国际集团）。
6孔板
注意：鸡蛋往往会粘在新的塑料材料上。为了避免这种情况，重新我们ē相同板; s意味着用自来水清洗并风干。
手套（假阴茎血是一种强大的污渍！）
玻璃巴斯德吸管
注：浸泡其中自来水，以免粘在的胚胎小号。使用打火机平滑开口。准备一些与一个较大的开口（2 -使用用于在Phallusia鸡蛋收集金刚石3毫米）。
100毫升玻璃烧杯
水平旋转振动器（例如，VWR，目录号：444-2900）
1.5毫升微管
低-结合1.5毫升（例如，VWR，目录号：525-0230）和2毫升（例如，VWR，目录号：525-0232）微管
4 mm 电穿孔比色皿（例如Dutscher，目录号：38191）
凹陷载玻片：4 mm（Dutscher，目录号：065230）和 1.5 mm（Dutscher，目录号：65227）的厚度
钨针（Roboz Surgical Instrument Co.，目录号：RS-6065）
成年海鞘是通过潜水、拖网或挖泥船从海洋中收集的，由欧洲研究基础设施 EMBRC 的法国节点提供（Station biologique de Roscoff：Phallusia mammillata和Ascidia mentula ；Station Marine de Banyuls-sur-mer：Phallusia mammillata ，Phallusia fumigata ，Ascidia mentula ，并Molgula appendiculata ）
报告基因构建体的超螺旋环状质粒 DNA (20 - 100 µg)
氢氧化钠，2.5M
氢氧化钠，1M
1 M Tris，pH 9.5
0.96 M D-甘露醇溶液（VWR，目录号：25311.297）
TE（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）
25％戊二醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）
巯基乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：T0632）
链霉蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P5147）
0.2 µm过滤天然海水或人造海水（BASWH：见配方）
Phallusia和Ascidia d回声溶液（见食谱）
Molgula dechorionation 解决方案（见食谱）
PBTw（见食谱）
10 × PBS（见食谱）
X-gal 染色溶液（见配方）
X-gal 原液（见配方）

设备

剪刀和镊子
温控室设置在 18°C
活胚胎操作的解剖范围（例如，蔡司的 Discovery V8）
方波电穿孔器（Harvard Apparatus，BTX ECM830，目录号：45-0052）
孵化器
解剖范围配备有一个数字照相机用于染色分析（例如，发现V20 + AxioCam型Erc从蔡司5S）

程序

的体内转录测定法进行根据这些连续的步骤：1）收集配子，2）蛋dechorionation，3）施肥，4）DNA电穿孔，5）胚胎固定和染色，和6）的数据收集和分析。前 4 个步骤因物种而异。在这里，我提出2个版本：一为P. mammillata ，P.熏蒸，和A. mentula （含有少量的变化之间的物种）; 和M. appendiculata 之一。

图 1. 成年海鞘物种。（A）Phallusia mammillata （5 - 20cm长）。（B）Phallusia fumigata （5 - 20cm长）。（C）Ascidia mentula （4 - 10cm长）。（d）Molgula appendiculata （3 -长6厘米）。

配子收集
海鞘是雌雄同体的。其目的是同时收集鸡蛋和配子，分别，从每个个体。
假阴茎和海鞘
P. mammillata ，P.熏蒸，和A. mentula属于同一家庭，Phlebobranchia。通过解剖从性腺收集配子。为了避免不必要的自体受精，先收集卵子。所有物种都有透明的卵。
打开的通过之间切割用手术刀动物2个虹吸管（图2A）。阴茎外衣又厚又硬。
将外衣向两侧的动物底部切开。做ñ Ø牛逼切割过深，以免损坏动物。
用手指拉开束腰外衣。
将动物转移到其左侧的盘子中（您应该看到心脏在动物底部跳动，与虹吸管相对）。如果动物在右侧，您应该看到一个充满卵的大的、淡黄色（假阴茎，图 2C）或淡红色（海鞘，图 2B）的输卵管。
使输卵管小切口和收集的鸡蛋巴斯德吸管（图2D）。
Ñ OTE：在输卵管的卵是非常紧凑的并嵌入在克EL atinous物质。使用wide-孔巴斯德吸管的Phallusia ; 否则，它们通过移液管的小开口吸入可能会导致极度变形和卵子死亡。死蛋很容易被发现，因为它们变得不透明。

图 2. Phallusia和Ascidia 中的配子集合。（A）示出了示意性的连续的切口图（编号为红色虚线）以打开外衣（左：与两个虹吸管指向侧视图到左侧;右：侧面图与两个虹吸管朝向实验者指向）。(B) 解剖A. mentula个体，其中性腺暴露。(C) 解剖P. mammillata个体，其中输卵管清晰可见。（d）卵收集在P. mammillata使用宽-孔巴斯德吸移管。(E) P. mammillata蛋。(F) A. mentula蛋。比例尺：D 和 E 中的 100 µm。

转移的鸡蛋到一个装满海水的6孔板。Phallusia个体通常具有一个高数蛋（0.5 - 2毫升蛋）。Ascidia通常有较少的鸡蛋，但量能达到0.5 - 1毫升。
检查的蛋质量（透明而均匀卵细胞质，图2E和图2 ˚F ）并传送它们到一个玻璃管中洗涤几次与海水。卵可以保持过夜，在14℃下，传播ö n中的陪替氏培养皿，没有大的降低在质量。
取出卵子后，您应该会看到输卵管下方的输精管（尖锐的白色导管）。使一个小的切口，并收集所述精子到1.5 -毫升管使用用于巴斯德吸管Phallusia或微量移与黄色尖端。避免收集海水、碎屑和血液。干燥的精子在 4°C 下可保持活跃数天。

莫古拉
与Phallusia和Ascidia 不同的是，微小输卵管中的卵很少（图 3D）。配子是第erefore由性腺收集人清扫。从性腺收集的卵母细胞代表卵子发生的所有阶段。该程序旨在收集主要是尚未成熟的完全发育的卵母细胞，如存在大的生发囊泡 (GV) 所证明的那样。幸运的是，这些卵母细胞成熟的自发在海水中，和胚泡破裂（GVBD）30内发生- 60分钟。
打开该用剪刀动物，从一个虹吸动物周围开始一路其他虹吸（图3A）（M. appendiculata都覆盖着碎片，贝壳，和石头; ü SE大剪刀和使周围这些障碍你的方式） .
拉开束腰外衣，拖动仍由虹吸管连接的动物（图 3B）。
用细剪刀将体壁从虹吸管剪到虹吸管，然后拉开动物（图 3C）。
在解剖范围下，用镊子在咽篮下找到性腺（动物的每一侧，图 3C）。您应该看到指向虹吸管的短性腺管和一侧被睾丸覆盖的大卵巢（图 3D）。
用剪刀剪下每个性腺，并将它们放在装满海水的 6 孔板的同一口井中（图 3E）。

图 3. Molgula appendiculata 中的配子集合。(A) 示意图说明切口 (红色虚线) 执行打开外衣 (左: 侧视图, 两个虹吸管指向顶部; 右: 侧视图)。(B) 去除束腰外衣（左侧）后的个人（右侧）。（C）剖开的具有性腺可见动物以在每一侧的中心。(D) 每个性腺由一个被睾丸包围的卵巢组成。入口示出了靠近-微小spermiduct（顶部）和输卵管（底部）的放大视图，两个开口指向右侧。其中性腺对（E）A 6孔板从4个个体已经被收集。(F) 在完全生长的卵母细胞自发成熟后获得受精卵 (比例尺: 50 µm)。

下的解剖范围，松开的从卵巢的卵母细胞使用镊子，和睾丸转移至培养皿填充有海水（60 -mm直径ETER ）。您应该看到各种卵母细胞（从微小的透明卵母细胞到带有 GV 的大的、不透明的、完全生长的卵母细胞）。
传输所有的通过从一个个体（2个卵巢）卵母细胞中一个300放置在100μm筛毫升玻璃烧杯（性腺碎屑不会通过）。
传送内容的第烧杯到一个120微米筛，并与海水广泛洗到删除精子和卵母细胞小。
转移的卵母细胞于60毫米的琼脂糖包被的培养皿中。
等待30 - 60分钟，直到发生GVBD并产生受精的卵母细胞。
释放的从精子的那公顷的所有个人的睾丸VE在相同的培养皿中解离通过用镊子每个睾丸被收集（丢弃该测试ë š事后）。收集集中的精子溶液置于15 -毫升的塑料管中并保持在4℃直至使用。

卵脱层
保护绒毛膜小号卵子制成的内部卵黄膜的组成的细胞外物质和毛囊细胞的外泡沫层。为了执行电穿孔，有必要除去它; Ť他的使用巯基乙酸钠和链霉蛋白酶的混合物来实现的。每种化合物的浓度和脱膜作用的持续时间因物种而异。
注：去绒毛通常在受精前进行，裸卵仍可受精。对于 Molgula，由于该过程相当快，因此可以在受精后进行。

收集的鸡蛋在玻璃管中，并允许他们到沉在底部。
丢弃了多余的海水。
激活的通过提高pH dechorionation溶液（添加3滴（约100微升）（Phallusia / Ascidia （）或6滴（约200微升）Molgula ）的2.5M的NaOH到7毫升dechorionation溶液使用巴斯德吸移管，并混合）。
继续装饰
我n以下的琼脂糖涂层培养皿为Phallusia / Ascidia ，通过将卵到dechorionation溶液（〜7毫升对于60 -毫米培养皿中并〜14毫升用于92 -毫米皿）。充分混合并以 ~70 rpm 的速度放置在水平振动筛上。
我Ñ一个玻璃管Molgula ，加入3 - 4毫升dechorionation溶液。通过上下移液充分混合。
定期检查范围内的除皱状态。Dechorionation需要30 - 45分钟（Phallusia / Ascidia ）和7 - 15分钟（Molgula取决于）的蛋密度。
停止dechorionation当大部分鸡蛋都没有明确的的绒毛。Phallusia / Ascidia ：通过旋转盘子在中心收集鸡蛋并将它们转移到15 ml 玻璃管中。将海水加入顶部并通过上下移液轻轻混合。Molgula ：丢弃尽可能多dechorionation解决方案尽可能。将海水加入顶部并通过上下移液轻轻混合。
注：Dechorionation更难以用Molgula遵循：当毛囊细胞迅速消失，卵黄膜是比较难看到（看近LY ，改变的范围镜方向;测试单元的蛋的表面上的存在是一个很好的迹象是的鸡蛋没有完全dechorionated）。
洗广泛2 - 4次被允许荷兰国际集团的鸡蛋，以安定下来，更换的海水，并轻轻地用巴斯德吸管混合。碎片（绒毛膜和死卵）会漂浮，而裸卵会迅速沉入管底。裸鸡蛋易碎易爆；动作要轻柔，避免气泡。
您可以使用同一管继续下一步，或将鸡蛋收集在琼脂糖涂层的培养皿中以备后用。Dechorionated ，未受精卵可存储过夜，在4 - 14°与质量没有大的下降℃。

施肥
（Phallusia / Ascidia只）添加5μl的干精子到一个1.5 -含有1ml海水毫升微管中。
（可选）使用纯精子溶液通常可以有效受精；^ h H但是，要实现一个完整的受精率和高同步性，最好是通过提高pH值（在海洋，精子激活精子的解决方案是由海水的弱碱性pH值激活）。添加任一50微升1中号的Tris pH值9.5（Phallusia ），4微升1中号的NaOH（Ascidia ），或8微升1中号的NaOH（Molgula ）到精子溶液。
注意：也可以通过将 1 ml 混合物与 20 µl 绒毛膜卵一起孵育 15 分钟来激活阴茎精子，如Sardet 等人所述。( 2011) 。
检查的通过的等分试样稀释50精子活力- 100 ×在海水和外表下在高放大倍率的解剖范围ING。精子应该疯狂地游动。
添加〜200微升（60 -毫米培养皿）或400 - 500微升（92 - mm皿或15 -毫升的玻璃管）精子溶液。
拌匀，麦荷兰国际集团的鸡蛋漂浮在介质中。你应该看到的精子游泳集中。
检查对发生的蛋变形小号受精，并应前几分钟内可见茨。
在10 - 15分钟后的施肥，进行到所述洗涤以除去精子，因为该协议使用大批量的精子。（施肥一个培养皿）通过旋动盘收集在中心处的鸡蛋并将它们转移到一个15 -使用巴斯德吸移管毫升的玻璃管中。允许卵到沉降到管底部，弃去大多数使用海水的一个巴斯德吸管，通过轻轻倒出加起来清洁海水顶端向下倾斜管的侧面; 由流感略有相似之处彻底悬浮鸡蛋^ h荷兰国际集团的海水用吸管。重复此洗涤1 - 3 × 。
注：胚胎没有他们的保护绒毛膜是脆弱的，一旦他们进来爆炸到与水/空气界面接触。小心谨慎；轻轻操纵它们，避免气泡。

DNA电穿孔
制备的DNA（20 -在50微升TE 100微克）。
加入 200 µl 0.96 M D-甘露醇并混合均匀。
收集的在玻璃试管底部受精卵。
标记用钢笔，在100上的低结合1.5μl的水平毫升管。
转移的受精卵进入的1.5 -毫升低-结合管。尝试将相同数量的鸡蛋添加到每个管中（每个要测试的构建体一个）。
用海水将体积调整到 100 µl 标记。
向每个管中加入 250 µl DNA/甘露醇溶液。
Ñ OTE：甘露醇是用来减少所述盐的浓度（并由此避免电弓ING电穿孔期间），同时保持所述容量渗透摩尔浓度在足够的水平。
转移的总混合TURE到电穿孔杯中（使用不同的巴斯德吸移管为电子ACH管，以避免混合DNA）。
将比色皿放入电穿孔器比色皿支架中。
应用 37 V ( Phallusia / Ascidia ) 或 20 V ( Molgula )的单个电脉冲32 ms。脉冲应该朝向第一细胞周期（但切割之前）的端部来进行：在50 - 60分钟后的受精。
Ñ OTE：电穿孔可以进行受精后任何时间和定时不影响的电穿孔效率; ħ H但是，受精卵是第一细胞周期的最后三分之一期间更坚固以电穿孔（而且显微注射）。
继续进行下一个构建体的电穿孔。
完成所有电穿孔后，在比色皿中加入一些海水，然后将鸡蛋转移到 92毫米琼脂糖涂层的培养皿中（一次电穿孔通常至少需要两个培养皿）。
注：共有4 - 6次电是常规做每施肥轮。根据经验，可以进行10 - 12 次电穿孔。
检查解剖范围下的菜。您应该看到完整的胚胎（因为它们接近第一个细胞周期的结尾，您应该看到与第一次卵裂的准备相对应的肌浆和/或变形）和爆炸卵的碎片。
注意：对于具有透明卵的物种（Phallusia/Ascidia），死卵变得不透明后很容易被发现。在大多数情况下，有一小部分卵子无法通过电穿孔存活下来；Ť他瑟对应于易碎或未受精的卵子。如果s其中你会发现没有幸存的胚胎，主要有两条方面的解释：在受精失败（未受精卵的电脉冲后，系统爆炸）或电压过高。尽量让两个实验控制小号：非dechorionated和非电穿孔胚胎，并dechorionated和非电穿孔胚胎。
转移的菜肴的培养箱设定在所需的温度。
注意：14 - 19°C 是所有物种的共同温度范围。它们也可以在较低的温度下很好地发育，但速度会显着降低。Phallusia/Ascidia 在高达 22°C 的温度下也能很好地发育。
冲洗海水用巴斯德吸管传播胚胎（他们有一个非常高的倾向，以彼此粘住，如果他们是太接近）。避免移动的自卵裂球的8细胞期之前菜肴非常松散地附着到彼此。

胚胎固定和染色
根据报告基因的不同，行动过程可能会有所不同。在这里，我描述了使用的LacZ作为报告基因（检测荷兰国际集团β使用发色底物X-gal的β-半乳糖苷酶活性）。
允许胚胎来发展，直到将所需的阶段。
旋转盘子以在中心收集胚胎。
收集的胚胎使用的玻璃巴斯德吸管，并将它们转移到一个2 -毫升低结合微管中。
允许胚胎来解决和丢弃的多余的海水。
用固定剂（海水中的 0.2% 戊二醛）填充管子，然后用手指旋转管子 30秒。
修复在室温下恰好30分钟（过定影将废除β半乳糖苷酶酶活性，太轻一个固定可导致胚胎崩解）。
取出一半的固定液并加入 1 ml PBTw。通过反转 2 - 3 × 进行混合。
一旦胚胎已经沉降d ，用 2 ml PBTw 替换溶液，倒置混合，等待 10 分钟。重复此洗涤1 × 。
漂洗用于在X-gal的5分钟染色溶液。
替换为 250 µl 含有 0.4 mg/ml X-gal 的染色溶液（将 X-gal 原液稀释100 × ）。
孵育在37℃下（一个培养箱优选一个水浴，因为没有蒸发发生在管）。
不时检查蓝色染色（它会在几个小时内开始，具体取决于测试监管区域的强度）。
一旦染色充分（这可能需要几天时间，但这是一个永远不会产生任何背景的染色程序），在 PBTw 中洗涤 2 × 5分钟。可以在（Roure等人，2014 年；Coulcher等人，2020 年）中找到使用靶向细胞核的 β-半乳糖苷酶进行染色的典型例子。
后修复程序为在室温下或O / N在含有3.7％甲醛PBTw 1个小时，在4℃。
样品可以长期储存-项。

数据分析

数据采集
丢弃所述固定剂和洗涤2 ×在PBTw 10分钟。
传输所有的胚胎厚厚的抑郁症幻灯片。
将部分胚胎转移到薄的凹陷幻灯片上。
使用解剖范围和一个钨针，得分的数量染色的胚胎在靶组织，直到到达100 - 200刻痕胚胎或直至所有的在管胚胎已经取得（评分只有那些已发育正常胚胎）（罗亚等人，2014 年；Coulcher等人，2020 年）。
ñ OTES：
胚胎可以很容易地使用钨针被操纵，猫晶须，或睫毛。
根据目的，该方法不仅可以通过对染色胚胎的数量进行评分，还可以通过对每个胚胎的染色细胞数量进行评分来改进；ħ H但是，这可能是耗时的。
不要忘记，这种转基因方法会产生镶嵌转基因表达（每个细胞随机遗传了可变数量的质粒 DNA），并且每个胚胎都是一个独立的事件；因此，给定区域的活性是通过编译所有被分析胚胎中的表达来确定的。
以图像的代表胚胎。

顺式调节活性的评价和比较
该测定提供定性数据（即，给定基因组 DNA 片段的空间活动域），但染色胚胎的百分比也反映了调控区域的强度。
获得可以从实验变化根据实验得分的海鞘批次，质粒DNA的制备，并在电穿孔期间胚胎浓度; 吨HUS ，我们通常进行至少3次生物学重复（不同海鞘，不同天的实验）和计算平均得分和标准偏差。
Ñ OTE：长（4 - 10 KB）的基因组区域通常是强烈活性（染色是温育1个小时内可见，在37℃，用超过90％的胚胎染色），并且不显示实验之间太多变化。
通常，该测定的目标是定位必需的顺式调节元件；因此，需要比较各种结构的活性。显然，质粒骨架应该是相同的。我们也赞成比较的具有相同的实验过程中被电结构的结果。

食谱

Banyuls-sur-mer 人工海水 H EPES (BASWH)
BASWH是一个“地中海型”海水，具有以下特性：37.9克/升，1219 mOsmole，钠的重量克分子渗透压浓度盐度+ / K +比率的47 ，且pH的〜8.0。
为1升，米IX ：
30.34 克氯化钠
0.83 克氯化钾
1.47 g CaCl 2 · 2H 2 O
4.98 克 MgCl 2 · 6H 2 O
6.29 g MgSO 4 · 7H 2 O在 MilliQ 水中
调整到 1 升
在这一步，溶液可以在室温下储存数月。
使用前，加入 0.18 g NaHCO 3和 5 ml HEPES 1 M pH 8.0，并滤液 (0.2 µm)。可以被存储为1 -在4℃下2个月。
假阴茎和海鞘脱膜液
1%巯基乙酸钠
0.05% 链霉蛋白酶在海水中
中号IX中的巯基乙酸通过摇动，加链霉顶部海水-没有混合-并保持在4℃下一个使用前几个小时。
在 4°C 下可使用 1 - 2 周。
使用前将等分试样置于室温。
Molgula dechorionation 解决方案
0.5% 巯基乙酸钠
0.1% 链霉蛋白酶在海水中
中号IX中的巯基乙酸通过摇动，加链霉顶部海水-没有混合-并保持在4℃下一个使用前几个小时。
在 4°C 下可使用 1 - 2 周。
使用前将等分试样置于室温。
PBTw
PBS 1 ×含 0.1% Tween-20
PBS 10 ×
对于 1 L，添加：
80.0 克氯化钠
26.8 克 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O
2.0 克氯化钾
2.4 克 KH 2 PO 4
用 NaOH 将 pH 值调至 7.4
乙环至1L ，并高压灭菌
X-gal染色液
1 mM 氯化镁l 2
3 mM K 4 Fe(CN) 6
PBTw 中的3 mM K 3 Fe(CN) 6
X-gal 原液
40 mg/ml X-gal 在二甲基甲酰胺中

致谢

该协议用于Coulcher等人的研究“在不同的海鞘胚胎中保护周围神经系统形成机制” 。，于 2020 年在 eLife 上发表（doi：10.7554/eLife.59157）。由于 G. Diaz（法国 Port-Vendres 的专业渔民）和 Banyuls-sur-mer 和 Roscoff 海洋站的工作人员（潜水员和船员）的知识和慷慨，提供成年海鞘使这项工作成为可能（欧洲研究基础设施 EMBRC 的法国节点）。我要感谢我小组的成员。这项工作是由法国国家科学研究中心和索邦Üniversite电，并通过从ANR（ANR-11-JSV2-007和ANR-17-CE13-0027），国家科学研究中心（DBM2020与InSb）具体的资金支持，以及欧洲项目组装加（ H2020-INFRAIA-1-2016-2017；授权号 730984）。

利益争夺

有没有利益或竞争利益冲突小号。

参考

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