材料和试剂

A、根部清理
1. 根材料/植物
2. 乙醇（EtOH）（费希尔科学公司）
3. 蒸馏水（dH2O）

B、根清除和染色
1. 非滤嘴吸管头（SARSTEDT）
2. 2毫升微型离心管（Eppendorf）
3. 蒸馏水（dH2O）
4. 蓝墨水（谢弗，目录号：94221）
5. 甘油（Sigma-Aldrich）
6. 冰醋酸（Sigma-Aldrich）
7. 乙酸（C2H4O2）（Sigma-Aldrich）
8. 乳酸（Sigma-Aldrich）
9. 氢氧化钾（KOH）（费希尔科学公司）
10. 染色液——10%的谢弗蓝墨水和25%的冰醋酸（见配方）
11. 去污溶液1–1%醋酸（见配方）
12. 去污溶液2–50%甘油（见配方）

C、显微镜
1. 玻璃载玻片76 x 26 mm/0.8-1.0 mm（Thermo Fisher Scientific）和18 x 18 mm/0.16-0.19 mm（VWR）
2. 透明指甲油
3. 安装液-半永久性载玻片用50%甘油，永久性载玻片用PVLG（聚乙烯醇-乳糖-甘油）（见配方）

设备

A、根部清理
1. 冰箱或冷藏箱
2. 洗涤瓶
3. 油漆刷
4. 边浅的小塑料盘子
5. 密封容器，用于储存清洁的树根（也可使用猎鹰管或玻璃罐）
6. 钝钳

B、根清除和染色
1. 手术刀刀片
2. 钝钳
3. 洗涤瓶
4. 2个微型离心管架（其中1个应耐热）
5. 水浴（我们使用镍电公司-克利夫顿）
6. 装有单个浅槽的洗涤盘（可以是玻璃、塑料、金属或陶瓷）
7. 塑料托盘
8. 微量加样器

C、显微镜
1. 体视显微镜（徕卡，型号：MZ6），卤素冷光源（Volpi，型号：Intralux-4001）。所需目标：10x、20x、40x、63x（仅限MucFRE）
2. 光学显微镜（徕卡，型号：DMLB）连接到相机（徕卡，型号：DMC5400）
3. 缝纫针或针
4. 加热烤箱（仅适用于永久滑道的PVLG安装溶液）

软件

1. 徕卡应用套件（LAS）成像软件4.13版（徕卡）

程序

A、根部清理
1. 从植物中提取根（图1A），用水冲洗根部，使其松动并去除基质。保持叶子直到真菌寄主植物和它的根系的身份被证实。轻轻地将真菌寄主植物与缠绕在一起的根系分开，避免切断根部（图1B）。

图1。图片显示野生采集的石松对根的染色。 A、成熟的田野收集的水淹花植物（插图）显示其土壤基质在筛网中清洗前。B、整个水田植物根茎（平均4厘米长），根完整，与土壤基质分离，75%干净。C、微型离心管（2毫升）安装在水浴架上（插图：金属耐热架中的管）。D、带有单个孔的染色板和玻璃染色块的示例（插图）。E、用吸管容器盖覆盖染色板。

2. 将单株植物或根系放入一个小塑料盘中，用dH2O湿润；始终保持湿润。
3. 用漆刷轻轻地刷掉根部表面的基质，用立体显微镜和钝镊子将植物固定在原位；避免粗糙的鬃毛和粗糙的擦洗，以保护根毛和表皮细胞。
4. 根据需要，在培养皿中刷新水，并使用洗涤瓶喷嘴用dH2O冲洗根部，以减轻基底的压力，直到没有碎屑残留（图1B）。
5. 清洗后，将根贮存在密封容器中，室温下浸在70%乙醇中长达1年，或在3°C的dH2O中短期储存。

B、染色准备
1. 将水浴槽预热至100°C，盖上盖子以加速加热并避免蒸发。
2. 用锋利的手术刀将清理过的根样本切成约1厘米长的碎片（为了便于以后准备玻片）。用钝镊子处理牙根以避免损伤组织。
3. 对于储存在dH2O中的根，进行“清除”（程序C）。对于储存在乙醇中的根，将2-3个根段放入清洗盘或清洗块的每个孔中（图1D）。
4. 用dH2O冲洗3 x根部，确保根部完全浸没。

C、根清除
1. 将根部转移到微型离心管架中（样品）标记的微型离心管（每个管2-3根），开始清理（图1C）。
2. 用移液管将10%的氢氧化钾吸进微型离心管中，使根部浸没（大约1毫升）。
3. 将这些管子转移到耐热微型离心架上，并放置在水浴槽内（见图1C插图）。在煮沸过程中不要把塑料托盘盖打开。
4. 根据根部厚度煮15-25分钟（见注5、6、7）。
5. 将温度降低到60°C（这需要大约15-20分钟的时间，盖上盖子），然后让试管继续孵育（对于黑鲷来说，再等15分钟，对于L.inundata，则需要30分钟）。
小心地将试管从水浴槽转移到台式微型离心管架上。
6. 用移液管从根部样本中取出KOH溶液，并用H2O冲洗3 x。

D、染色
1. 向染色样品中加入染色液，确保它们完全浸没，不会粘在一起。
2五十、洪水五十、洪水：将染色样品置于100°C的水浴中3分钟。
S、黑鬼：将管置于室温下1 min 30 s（见注释5、6和7）。

E、去染色
1. 用钝镊子将牙根移到清洗盘（图1D）中，并向每个孔中添加大约1mL的去染色溶液1（见下文，1%乙酸），以去除多余的染料。继续给药1%的醋酸，直到蓝色染料痕迹消失（见注释5、6和7）。
2. 在最后一次醋酸清洗时，确保所有根部浸没并彼此分开。为防止蒸发，在洗涤盘上盖上盖子（图1E）。
3. 隔夜去污。
4. 用去污液2（50%甘油）代替1%的醋酸，足够的体积覆盖根部。

F、幻灯片准备
1. 准备半永久性载玻片时，在载玻片中央加入一滴50%的甘油。
每一份保险单只应包含一到两个根部段。
2. 用钝镊将一到两个根节段转移到甘油池中。
3. 将牙根尽可能平放在载玻片上，然后使用针头和立体显微镜将牙根居中，并扇出较细的尖端（见注4）。
4. 轻轻地将玻璃盖套在根部，避免产生气泡。
5. 为了防止指甲边缘脱落，在指甲边缘涂上一层干燥的指甲油。

G、成像
使用这种技术的光学显微镜图像见图2。

图2。酸化的长颈鹿蓝色墨水染色根的显微照片。黑接骨木：A/B.无间隔丛枝菌根（AMF）样胞内菌丝（h）和囊泡（v）。C、粗大的有隔膜的菌丝形成细胞内有节的簇。石松属：D.菌根毛细胞的细节显示细根内生菌（FRE）菌丝进入表皮细胞。E、根毛细胞中的一对大的小泡。F、毛状根毛细胞被毛霉菌样弗雷菌（Mucoromycotina-like-FRE）克隆。显微照片是使用徕卡应用套件（LAS）成像软件4.13版（Leica）制作的，使用光学显微镜与相机耦合。所需目标：40倍和63倍（仅适用于FRE）。

笔记

1. 将植物（及其附着的基质）（图1A）储存在3°C的冰箱中（如有可能），并在3天内处理样品。
2. 染色准备：如果可能，选择一系列的根直径和年龄。
3. 去染色：尽管真菌结构通常在2小时后可见，但我们建议过夜以提高分辨率。
4. 幻灯片准备：
a、对于厚根或木本根，可能需要将样本组织压平，以便盖玻片粘附。在这种情况下，用钝镊子轻轻敲打盖玻片，使组织变平。如有需要，可通过毛细管作用在盖玻片下加满甘油。
b、制备永久性载玻片时，可在步骤F1中使用几滴PVLG安装溶液代替甘油。一旦盖好封条，需要在60°C的烤箱中放置一夜，然后才能用指甲油密封。
5. 本方案中的以下参数在物种之间，有时在从不同地点采集的物种内会略有不同：
a、清理时间：15-25分钟。
b、染色温度：100°C或室温。
c、染色时间：1-3分钟。
d、脱色洗涤次数/脱色时间（以50%甘油计）。
6. 最佳染色参数根据根的不同而不同（例如年龄、厚度、木质度、植物种类）。例如，幼根较薄，很容易被染料浸透，需要更短的染色时间，脆弱的根样本在染色过程中煮沸可能会分解。此外，与柔软的根相比，木质根可能需要更多的甘油洗涤液（或更长时间的洗涤液）才能完全去渍。
7. 如果剩余材料可用，在开始之前，我们建议测试类似条件和尺寸的根部，以确定最佳设置（清理步骤的沸腾时间为15、20或25分钟，染色为室温或100°C，时间为1、2或3分钟）。对于去染色，有必要根据染料渗出的量和根的暗度来判断是否需要更多的甘油洗涤。
8. 对于有助于观察根组织内丛枝菌根真菌和暗隔内生真菌的染色生理结构的示例，我们建议参考Priyadharsini等人2012年和Thangavelu and Muthuraja，2016年的工作。
9. 所有溶液在室温下储存并在1个月内使用。

食谱

1染色液1染色液
a、通过向500 ml dH2O中添加125 ml冰醋酸，制备25%冰醋酸储备溶液
b、在225ml 25%冰醋酸中加入25ml的舍法尔蓝墨水，配制成10%的舍法尔蓝墨水，混匀
2. 去污溶液
a、去污剂（1:99醋酸溶液）
向247.5 ml dH2O中添加2.5ml乙酸
b、脱色液2:50%甘油（1:1）
在125ml的dH2O中加入125ml甘油
反复摇匀
3. 安装解决方案
a、 50%甘油（同上）
b、 PVLG（可选）：将8.33 g聚乙烯醇溶解于50 ml dH2O中，然后添加5 ml乳酸和5 ml甘油，充分混合（如之前Omar等人所述，1978年）

致谢

我们要感谢英国皇家植物园实验室工作人员的支持。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的利益。

工具书类

1. Ager，A.（1991年）。外生菌根的特征。作者：Norris，J.R.，Read，D.J.和Varma，A.K.（编辑）。《微生物学方法》，第23卷，第25-73页，伦敦，英国：学术出版社有限公司。
2. Brundrett，M.C.，Melville，L.和Peterson，R.L.（1994年）。菌根研究的实用方法。加拿大滑铁卢：Myologue出版物。
3. Kowal，J.，Arrigoni，E.，Serra，J.和Bidartondo，M.（2020年）。水淹石松种群菌根定殖的流行性和物候学。：2020.2005.2007.080192。生物14
4. Omar，M.B.，Bolland，L.和Heather，W.A.（1978年）。真菌的永久性培养基。53（5）：293-294。斯坦泰诺
5. Phillips，J.M.和Hayman，D.S.（1970年）。改进的程序，以清除根和染色寄生和泡状丛枝菌根真菌，以快速评估感染。55（1）：158英寸118英寸。英国麦考索
6. Priyadharsini，P.，Pandey，R.和Thangavelu，M.（2012年）。传统农业条件下葱丛枝菌根与暗隔真菌的共生关系。71:159-175。植物学报
7. Thangavelu，M.和Muthuraja，R.（2016年）。芦笋丛枝菌根和暗隔内生真菌的共生关系。40:662-675。土耳其J机器人
8. Vierheilig，H.，Coughlan，A.P.，Wyss，U.和Piché，Y.（1998年）。一种简单的丛枝菌根真菌染色技术。64（12）：5004-5007。应用环境微生物
9. Vierheilig，H.，Schweiger，P.和Brundrett，M.（2005年）。根丛枝菌根真菌检测与观察方法综述。125（4）：393-404。生理植物
10. Wilkes，T.I.，Warner，D.J.，Edmonds Brown，V.，Davies，K.G.和Denholm，I.（2019年）。两个冬小麦品种根皮层丛枝菌根真菌细胞内组分染色和定量方法的比较。2（2）。Acc公司ess微生物学