材料和试剂

手术
32号小轮毂RN NDL; 自定义规格：点样式4 12斜面，长度1英寸（汉密尔顿公司，目录号：7803-04）
2.5 μ升模型62 RN注射器（汉密尔顿公司，目录号：7632-01）
酒精湿巾（Covidien）
出生后28-80岁的实验小鼠
红色Retrobeads TM （Lumafluor Inc.）
绿色Retrobeads TM （Lumafluor Inc.）
异氟烷（Vedco ，IsoSol ）
牛油果饮食（生物服务）
Paralube opthalamic 软膏（Dechra ）
维邦（3M）
0.9％NaCl无菌溶液（Hospira）
局部镇痛药：利多卡因（阿斯特拉，木糖胺）
三联抗生素药膏（Actavis）
抗生素：Baytril （拜耳）
镇痛药和非甾体类抗炎药：
卡洛芬（Zoetis，Rimadyl ）

酮洛芬（Zoetis，Ketofen ）

我布洛芬（儿童莫特林）

行为
测试盒，尺寸（60 x 60厘米）
2种不同样式的塑料玩具老鼠（Amazon）
与年龄组匹配并与测试小鼠一起饲养的成群饲养的熟悉的前哨小鼠
对于疾病模型，最佳做法是使用与实验对象具有相同遗传株系的野生型小鼠。

与实验小鼠年龄匹配的成群饲养的新型前哨小鼠
标准鼠标床上用品
异丙醇（Fischer Scientific）

经心灌注
蝴蝶针（精细科学工具）
BD通用和精密滑行皮下注射针头，规格25针，1.5英寸（Fisher Scientific，目录号：14-826）
BD防滑无菌注射器（Fisher Scientific，目录号：14-823-434）
封口膜
氯胺酮（Vet ONE，Zetamine ）
赛拉嗪（Lloyd，AnaSed ）
Na 2 HPO 4· 7H 2 O（Sigma - Ald rich，目录号：S7907）
NaCl（Sigma - Ald rich，目录号：S7653）
氯化钾（Sigma - Ald rich，目录号：P9333）
KH 2 PO 4 （Sigma - Ald rich，货号：74092）
32％多聚甲醛水溶液（Electron Microscopy Sciences，Fisher Scientific，目录号：50-980-494）
琼脂
腹膜内注射麻醉剂（参见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（请参阅食谱）
1x PBS中的4％多聚甲醛（请参阅食谱）
琼脂块（请参见食谱）

组织准备
鹘TM 聚苯乙烯微孔板，12 - 以及，非处理（Fisher Scientific公司，目录号：08-772-50）
无菌手术刀片，第11号（羽毛）
钠叠氮化物（西格玛- Aldrich公司，目录号：S2002）
丙酮（Fisher Scientific）
脑部存储（请参阅食谱）

免疫组织化学
铝合金箔
矽胶（DAP）
抗c- Fos 抗体（Synaptic Systems，目录号：226004）
抗NeuN 抗体（Synaptic Systems，目录号：266006）
生物素化的山羊抗豚鼠抗体（载体实验室，目录号：BA-7000）
链霉亲和素与Alexa Fluor 405偶联（Thermo Fisher Scientific，目录号：S-32351）
与Alexa Fluor 647偶联的AffiniPure 山羊抗鸡IgY （H + L）（Jackson Immuno Research，目录号：103-605-155）
Gibco TM 山羊血清，新西兰来源，标准（无菌过滤）（Fisher Scientific，目录号：16-210-064）
牛血清白蛋白（Sigma - Aldrich，产品目录号：A7030）
海卫一X-100（Sigma - Aldrich，目录号：X100-500ML）
Fisherbrand Colorfrost plus显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-17）
Vectasheild 防褪色安装介质（Vector实验室，目录号：H-1000）
透明指甲油（电子显微镜科学，目录号：72180）
免疫组织化学通透溶液（请参阅食谱）
免疫组织化学阻滞溶液（请参见食谱）
免疫组织化学抗体稀释液（请参阅食谱）
孔插入（请参见食谱）

设备

手术
带数字显示控制台的小动物立体定向框架（Kopf，目录号：942）
异氟烷气化机（Ohmed ）
理发器（Norelco，菲利普斯）
医用氧气罐（AirGas ）
加热垫（瓦特隆）
直流温度控制器（FHC）
钻（Foredom ）
钻头（精细科学工具）
微型进样器（WPI，Micro4）
手术工具（精细科学工具）

行为
前大灯带红灯（Amazon）或红色头灯（Amazon）
可选：带长通红外滤光片的摄像机
可选：红外灯
灌注
Fisherbrand 直型微型剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-953-1B）
蠕动泵（Ismatec ）
手术工具（精细科学工具）

脑切片
通用数据Healthca re SHUR / Mark TM 骆驼毛刷套装
弧菌（Ted Pella，型号：Pelco100）

荧光显微镜
具有405、488、594和647 nm波长激光的共聚焦显微镜（Nikon A1）
20 x 物镜，NA 0.8或更高（尼康）

软件

ImageJ（NIH）或FIJI
Matlab （Mathworks ）或Excel（Microsoft）
棱镜（图形P 广告）

程序

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902722--1471 Lucas Pozzo-Miller 793013 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

图1.实验程序的时间表。在行为适应前一周向小鼠注射Retrobeads TM 。在1-3天，使小鼠适应测试室。在第4-6天，对小鼠进行处理（以减轻其焦虑），并使测试小鼠适应测试室。在第7天，将小鼠暴露于行为模式以进行标记和处死。

手术
笔记：

对于行为范例，每个笼子都需要一只非手术鼠标充当已知的哨兵。在成群饲养的雄性中，建议包括前哨在内的组为同窝，每个笼子的饲养笼数不得超过5只。应提供其他非手术新型前哨小鼠（年龄，性别和体型匹配，也成群饲养）进行行为测试。
在最终行为暴露和处死之前2周，将对被测试的小鼠注射Retrobeads TM ，在与年龄或疾病相关的研究中应考虑这一点（图1）。
到增量值ASE标签ING与Retrobeads TM ，2次注射小体积（大约250的NL 每个区域）提出了建议。通过在背腹轴上添加一个额外的位置（通过选择每个标准小鼠脑图谱中与区域边界等距的位置来确定）可以轻松完成此操作。
Retrobeads TM 可以轻易堵塞注射针。确保不要让Retrobeads TM 落入针头的时间超过严格必要的时间。为了减少此时间，每个背腹轴仅绘制足够的Retrobeads TM 并定期提供测试脉冲（分配少量〜1 nl ）。在背腹轴之间，用酒精湿巾擦拭针尖。通过发出测试脉冲并观察Retrobeads TM 的弹出，确保在插入大脑之前和之后没有堵塞针头。如果没有弹出Retrobeads TM ，则表明针头堵塞，无法（也可能没有）提供必要量的Retrobeads TM 。可以通过吸移PBS，将清洁管插入针头或将尖端浸入乙醇来疏通针头。经常阻塞针头会缩短针头的使用寿命。
本文使用的注入坐标是mPFC 和lHYP 的前缘（PL）区域。
为了确定注射部位，使用Paxinos ＆Franklin小鼠地图集找到了坐标（Paxinos 和Franklin，2008），并通过中试研究进行了验证。为了控制座标，可以注入黑色食用色素代替Retrobeads TM，并立即将大脑移开并用剃须刀切割。可以使用标准明场显微镜将部位可视化。
由于Retrobeads TM 进样可能很难掌握，因此请确保先进行试验数据集上的进样方案测试，然后再进行其余操作。
有关实验动物的所有程序均应经过机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。

等分试样Retrobeads TM 成小的PCR管，加入一个容积大于将被用于帐户毂损失（250 ñ 升X 每只小鼠注射位点的数目X 小鼠+ 250＃NL ）。
将汉密尔顿针头插入注射器，用无菌生理盐水灌注，确保针头中没有气泡。
在2.5 L / min的恒定流速下，使用用100％氧气稀释的4-5％蒸发的异氟烷麻醉诱导室中的小鼠。
给小鼠皮下注射镇痛药（例如2 mg / kg Ketaprofen ）。
使用标准的推子剃掉鼠标的头部，然后用酒精湿巾消毒头皮。
将鼠标置于立体定向框架中。将异氟烷减少至〜2％，并在整个手术过程中根据需要进行调整。
将眼药膏涂在眼睛上。
皮下给小鼠注射止痛药和抗生素。
使用微剪刀，在头皮上切一个足够长的切口，以同时看到前reg和λ。
确保使用立体定向框架的臂将头部弄平并笔直。拧紧耳棒以固定鼠标，请小心避免改变头的方向。
钻头在前reg处的零外侧和前后位置（连接到立体定向框架的一只手臂）。
在注射部位上方的头骨上钻孔，注意不要刺穿大脑。注射部位坐标是使用Paxinos 和Franklin小鼠脑图谱生成的（Paxinos 和Franklin，2008），并通过先期研究进行了验证。
画出足够的Retrobeads TM 来表示每个针头插入的进样次数+ 250 nl 。给出一个小的测试脉冲，以确保不会堵塞针头。
前b处的针头为零，将针头移至注射部位的中外侧和前后位置。将针降低到大脑中，必要时扩大毛刺孔。针刚进入大脑时背腹位置为零。
将针头缓慢降低至最深注射部位以下的0.002毫米，等待2分钟。给小测试脉冲以清除针头。
将针头缩回第一个注射部位，给小测试脉冲以保持针头清晰，等待2分钟。以每分钟250 nl 的速度注入Retrobeads TM 。注射完成后等待2分钟。
将针头缩回至最浅的注射部位，施加小的测试脉冲，等待2分钟，然后注射Retrobeads TM 。
根据注射深度，在5-10分钟内缓慢缩回针头。发出测试脉冲以确保针头没有堵塞。用乙醇湿巾擦拭针头。
对另一半球和任何其他区域重复注射程序。
完成所有注射后，在小鼠颅骨上滴入约1 ml 无菌盐水。用无菌薄纸擦干。
将切口两侧的皮肤拉在一起，注意不要折叠或重叠它们。用兽医粘接剂避开眼睛，鼻子/胡须和耳朵。
从异氟烷中取出鼠标，将鼠标放在恢复笼中的纸巾上，该恢复笼的位置应使一半笼位于加热垫上。鼠标应放在加热的部位。每只老鼠需要一个恢复笼，一旦老鼠起身行走，就可以将它们放回以前的社交团体中。
每天检查小鼠是否有切口打开和嗜睡。如有必要，请遵循批准的针对人道端点的IACUC协议。
图2显示了成功的逆行标记的神经元在腹腔CA1中的代表性实例，其投影到mPFC 和lHYP ，并且对神经元标记NeuN 和IEG c- Fos 进行了免疫染色。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902722--1471 Lucas Pozzo-Miller 793013 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2.成功的逆珠注入示例。将绿色Retrobeads TM 注入mPFC （A），将红色Retrobeads TM 注入1HYP （B）。观察到Retrobeads TM的扩散最小。注射后两周，可以在目标区域vHIP中观察到含有Retrobeads TM的神经元细胞体，该区域由它们与NeuN （C）的共定位确定。

表1显示了在成年C57 / B16小鼠中注射Retrobeads TM 期间用于靶向mPFC 和lHYP 的立体定向坐标。

表1. Retrobeads TM 注射坐标。用于立体定位注射圆盾坐标婷mPFC中和lHYP 为拉贝玲vHIP 投射神经元（从菲利普等人，2019）。

地区

前/后

内侧/外侧

背/腹

mPFC

1.45

+/- 0.5

1.45

1.40

羟脯氨酸

1.34

+/- 1.1

5.3

5.2

行为
笔记：

小鼠应在其最活跃的阶段（即黑暗周期）进行适应，处理和测试。
交互的时间很关键，因为c- Fos 表达在时间上与行为有关。
应该戴上红色的头灯，以便实验者可以看见但不会破坏小鼠的昼夜节律。
请注意，在任何鼠标-鼠标交互作用中，都存在激烈的战斗，如果发生伤害，请将小鼠从测试组中移出。使用顺序交互而不是组合交互，可以减少攻击性并增加每只鼠标花费的时间。

Retrobeads TM 注射手术后一周，小鼠应开始适应行为行为室。在开始的三天内，将鼠标笼（包括所有前哨笼）移至房间，让它们适应2-4小时，然后再将它们放回动物设施（图1 ）。
在第4-6天，应使小鼠适应手部和互动室。将干净的鼠标垫放在适应室内的底部。拿起每只鼠标并让它们坐在您的手中，大约每只鼠标要处理3分钟。3分钟后，或当小鼠平静下来时（以最长的一个为准），将小鼠转移到交互室中。应处理前哨小鼠，但不要将其移至交互室。
适应10分钟后，将小鼠从交互室中移出并返回到笼笼中。取出用过的床上用品，并更换成干净的。每天结束时，用70％异丙醇清洁交互室。
在贴标签的那天（第7天），从家庭笼子中取出哨兵，并在测试期间将其单独放置在干净的笼子中。请务必在笼子上打上好标记，以方便确定哪些小鼠是熟悉和新颖的哨兵。
使用随机数生成器将手术小鼠分为两组：将与其他小鼠互动的小鼠和与无生命物体（例如玩具小鼠）互动的小鼠。在每次互动之前，请确保用干净的被褥填充互动室的底部。
对于将与其他小鼠进行交互的测试小鼠，将其放置在交互室中并快速添加熟悉的哨兵（笼伴侣）。在返回各自的笼子之前，允许互动10分钟（图3）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902722--1471 Lucas Pozzo-Miller 793013 \ Figs jpg \ Figure3 .jpg

图3 。纪念日的示意图和意象。A.劳动节行为互动示意图。测试小鼠一直呆在自己的笼子里，直到相互作用之前。一组随机选择的小鼠将与玩具小鼠（对象条件）交互，而另一组将与活小鼠（社交条件）交互。将每个测试鼠标移至测试区域，然后立即添加玩具鼠标或同窝活体鼠标。在无限制互动10分钟后，将测试小鼠放回笼子中1小时。将测试鼠标放置在同一清洁的测试区域中，然后立即将其与第二只玩具鼠标或活的新颖鼠标连接。在无限制互动10分钟后，将测试鼠标放回其家中笼子。该测试小鼠被麻醉并灌注45分钟的最后一个相互作用的停止以下。B. 行为设置的管理，由可选的摄像机（装有长通滤光片）和位于测试箱上方的红外光组成。在此设置中，房间配备有红灯，但是也可以使用红头灯。

一个H 我们在最初曝光，回归测试鼠标交互作用室。快速添加新颖的哨兵（无笼伴侣），并允许他们互动10分钟。
对于与对象进行交互的测试鼠标，在添加测试鼠标之前，将一只假玩具鼠标放在交互室的角落。让交互作用10分钟，然后将测试鼠标放回家用笼中。
1小时后，将第二只假玩具鼠标放在另一个角落。添加测试鼠标，并允许互动10分钟，然后再将测试鼠标返回家中。
四十五分钟茨次后ë最后交互，使用麻醉剂混合物腹膜内注射麻醉和小鼠进行到transcardiac 灌流固定。

灌注
准备1x PBS和4％甲酰甲醛溶液，均置于冰浴中。
组装灌注系统和灌注管路，去除气泡。开始灌注前，请确保针头管路中不含对甲醛，因为灌注应从1x PBS开始，以清除所有血管中的血液。流速应约为4 ml / min。
在最后一次行为交际结束后的45分钟，通过腹膜内注射氯胺酮（100 mg / kg）和甲苯噻嗪（15 mg / kg）的麻醉混合物麻醉小鼠。在继续操作之前，请确保没有因脚趾夹反射而正确麻醉小鼠。
（可选）将鼠标固定到灌注托盘。打开胸腔，使用血细胞计数器将肋骨保持在不妨碍的位置。
将灌注针滑入心脏的左心室并将其固定到位。开始使用1x PBS灌注，并迅速在右心房做小切口以允许灌注溶液流出。
用1x PBS灌注直到血液中的灌注液清除为止，成年小鼠大约需要2分钟。切换至4％多聚甲醛溶液。灌注20分钟。
解剖大脑，注意不要在组织中形成缺口。将大脑浸入4％多聚甲醛中，并在4°C下储存过夜。
用脑存储溶液代替4％多聚甲醛（请参阅第5节）。
在下一次灌注之前，请确保使用1x PBS清除最终的多聚甲醛灌注线。

切片
使用前，将振动刀切割刀片在丙酮中浸泡约5分钟（以除去运输胶和油）。
用剃须刀大块地割伤大脑；确保保存注射部位以供确认。进行直线切割，留出足够的空间将大脑粘在切割卡盘上。
准备琼脂块，使侧面切成直角，并且比大脑稍宽和更高。使用氰基丙烯酸酯胶（例如Super Glue TM ）将这一面胶粘到切割卡盘的背面。
使用薄纸快速去除多余的大脑储存溶液，然后将大脑直接粘在切割卡盘上的琼脂块（靠近刀片）的前面。
将卡盘放置在震颤器中，并用1x PBS充满震颤器。
将脑切片切成30 µm的厚度用于c- Fos 免疫组织化学，切成100 µm的厚度以可视化注射部位。将连续切片按顺序存储在包含脑存储液的12孔板中。用Parafilm TM 密封孔板，并保存在4°C并避光直至变色。

免疫组织化学
笔记：

每个12孔板仅使用4孔插入物，以使介质更换更加容易并减少错误。当重复使用孔时，从孔中吸出用过的培养基，用1x PBS冲洗并吸干。要更换培养基，请用即将推出的解决方案填充干孔，然后将孔插入物移至新溶液中。
保持孔板覆盖锡箔，同时不要更换介质，以防止Retrobeads TM 被环境光漂白。
为了获得最佳结果，请同时对实验的所有切片进行染色，以避免组织处理产生不必要的变化。

每个大脑在12孔板内放置一个孔插入物。添加2-3米升1X PBS的。
使用画笔将每个大脑的五个30 µm切片小心地转移到孔中。
每个插入物用1 ml 透化溶液填充1个空孔。将插入物从1x PBS移至含有通透溶液的孔中。将孔板放在摇床上15分钟，用锡纸覆盖。
用1 ml 封闭液填充每个插入物1个空孔，将孔转移至块，更换振动筛板，盖上盖子，放置1 h。
准备一抗溶液。混合[1.25 ml 抗体稀释剂+ 2.5 µl 抗c- Fos + 2.5 µl 抗NeuN ] x 孔数。
每个插入物用1 ml的一抗溶液填充1个空孔，将插入物转移到孔中，更换振荡器上的板，盖上锡纸。将切片放在振动筛上约36小时。
用2 ml 1x PBS 填充空孔，转移插入物并洗涤5分钟。每次洗涤用新鲜PBS重复3次。
准备扩增抗体溶液。混合[1.25 ml 抗体稀释剂+ 6.25 µl 生物素化山羊抗豚鼠] x 孔数。
将孔插入1 ml 扩增溶液中，扩增2 h。
用2 ml 1x PBS 填充空孔，转移插入物并洗涤5分钟。每次洗涤用新鲜PBS重复3次。
准备第二抗体溶液。混合[1.25 ml 抗体稀释剂+ 1.25 µl 与Alexa Fluor 405 结合的链霉亲和素+ 6.25 µl 与Alexa Fluor 647 结合的山羊抗c hicken ] x 孔的数量。
在1个地方以及插入米升二次抗体溶液，让染色4小时。
用2 ml 1x PBS 填充空孔，转移插入物并洗涤5分钟。每次洗涤用新鲜PBS重复3次。
放1米升1×PBS中的在显微镜载玻片上。使用画笔，转移大脑切片的幻灯片。小心放置和展平各个部分。
使用移液器吸出多余的1 x PBS，同时重新放置切片。用薄纸擦干剩余的1 x PBS 。盖上锅盖直到干燥，〜5分钟。
在每个部分上滴一小滴Vectashield安装介质。小心放置盖玻片，避免产生气泡。
使用透明的指甲油，密封盖玻片的边缘并滑动。
在4°C的黑暗环境中存储，直到成像。

共聚焦显微镜和图像分析
注意：对于定量免疫组织化学，最好的做法是在同一天或连续几天对所有切片进行成像，以避免不必要的变异。至关重要的是，所有图像都是在显微镜下使用完全相同的设置来拍摄的，例如，物镜（尤其是NA），激光功率，停留时间（扫描速率），针孔孔径，PMT增益和偏移，光学部分之间的距离在z堆栈中，每个z堆栈中光学部分的数量，像素分辨率，扫描区域。

首先，设置激光功率，PMT增益和偏移，以便使用约75％的像素强度范围。确保从每种情况检查几个大脑部分，以确保这些设置适合整个数据集。在任何实验条件下（即避免图像饱和），任何图像中的像素均不得比最大像素亮。
推荐的设置包括：
针孔设置为1艾里单位，由共聚焦显微镜的图像采集软件确定。
可以通过稍微增加激光功率来补偿较低的增益。
仅使用最小的PMT偏移量。
通过行扫描对所有通道进行连续激励（即，不要同时进行激励，以避免频谱“泄漏”和移位）。
使用平均线（2个就足够了）。
使用方法1 ，024 X 1 ，024像素的图像大小，保存在16位像素深度分辨率。
如共聚焦软件所确定的，Z轴间隔设置为最佳。
根据每节标记的神经元数量，确定每节要为所需样本数（“ n”）拍摄的图像数量。在菲利普斯等人。（2019），从每一个部分的整个区域进行成像，并每Retrobeads TM -label 编神经元进行分析。这可能不是在其他脑区域可行S，取决于拉贝的密度导致NE urons。

数据一nalysis

注意：有关数据分析的工作流程，请参见图3。

在ImageJ（或FIJI）中打开图像（图4A）。
从所有通道中减去背景，设置为30像素（图4 B）。
去除c- Fos （蓝色）通道的斑点（图4 C）。
合并Retrobeads TM 和NeuN 通道（图4 D）。
设置测量设置以记录平均灰度值并重定向到c- Fos 通道（图4 E）。
如果对不同的投影神经元使用两种Retrobeads TM 颜色，请使用“通道”工具关闭Retrobeads TM 通道之一。调整亮度和对比度，以识别包含Retrobeads TM的单个神经元。
对于每个Retrobeads TM 和NeuN 阳性神经元，放大并滚动z平面，直到找到神经元最集中的平面（通常是最大的体细胞大小）。使用徒手选择工具跟踪神经元的轮廓（图4 F）。
在c- Fos 通道窗口上更改z平面，以匹配Retrobeads TM / NeuN 窗口。测量灰度值（图4 F）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902722--1471 Lucas Pozzo-Miller 793013 \ Figs jpg \ Figure4.jpg

图4.图像分析工作流程。首先打开图像，选中“分割通道”框，以便选项框与上图（A）相匹配。在所有通道（B）上减去滚动球半径为30像素的背景。去除c- Fos 通道（C）的斑点。合并Retrobeads TM 和NeuN 通道（D）。设置测量设置以记录平均灰度值，然后重定向到c- Fos 通道（E）。手动圈选包含Retrobeads TM （F）的NeuN 标签。确保将c- Fos 通道移动到相同的z平面，测量强度（G）。

所有重复步骤7,8 RETR obeads TM - 拉贝导致神经元。
测量背景的几个神经元大小区域的c- Fos 强度，并记录每个部分。
当强度收集完成后，将每节的平均背景强度填充到统计程序（即Prism）中，以1％的Grubb测试集确定离群值。从背景被确定为异常值的部分中删除神经元。
可以通过将每个神经元用作单独的“ n”或平均每个动物的神经元来显示数据。Phillips 等。（2019）选择以两种方式显示数据，随后进行统计测试。
确保对实验中的条件数量进行适当的测试（例如3向或2向方差分析）。Benjamani -Hochberg事后测试可用于条件之间的比较。

菜谱

10x PBS
25.6克N a 2 HPO 4 7H 2 O

80克氯化钠

2克氯化钾

2克KH 2 PO 4

放入1升双蒸馏水（ddH 2 O）

在室温下储存长达1个月

1x PBS
100 毫升10x PBS

900 米升的DDH 2 ö

在室温下储存长达1个月

腹腔注射麻醉混合物：氯胺酮（100 mg / kg）和赛拉嗪（15 mg / kg）
90 万升氯胺酮

0.1 米升甲苯噻嗪

在室温下储存长达1个月

1x PBS中的4％多聚甲醛
1000 万升37％PFA

70 米升1X PBS

每次使用都新鲜

脑部存储解决方案
10毫克钠叠氮化

广告d 100 米升1X PBS

在室温下储存长达1个月

琼脂块
200 米升1X PBS

800毫克琼脂

加热1x PBS和琼脂直到琼脂完全溶解
倒入100毫米的盘子
使其冷却至室温，并以4° C的温度包装在Parafilm TM 中
免疫组织化学通透溶液
10 米升1X PBS

250 μ 升的Triton X-100

储存在4 °C下长达1个月

免疫组化封闭液
10 米升1X PBS

10 μ 升的Triton X-100

1.1米升从次级抗体宿主血清（山羊）

200毫克牛血清白蛋白

225毫克甘氨酸

重新制作每种染色方案

免疫组织化学抗体稀释液
1000 万升大脑切片存储解决方案

100 μ 升的Triton X-100

505 μ 升二级抗体的血清主机（山羊）

200毫克牛血清白蛋白

使每个染色方案新鲜，不使用时存放在4° C

孔插入
5个注射器切成1英寸高

蚊帐

矽胶

用橡皮筋将蚊帐紧紧地拉在玻璃器皿的顶部
将硅胶涂在注射器末端
将注射器（硅胶涂层面朝下）放在网罩顶部
在注射器顶部增加砝码（例如硬币）以施加压力
晾干过夜，仔细修剪刀片周围的网和多余的硅胶
浸泡在1x PBS中过夜

Acknowledg 发言：

Phillips 等人首先报道了该协议。（2019）。NIH赠款R56-NS103089-01A1（LP-M），奇维坦国际基金会（MLP），NIH培训赠款T32-NS061788-04（MLP）和Rettsyndrome.org （LP-M）支持了这项工作。我们感谢Karen Ayala- Baylon 女士对小鼠菌落的维护。我们感谢UAB的生物统计学诊所'的临床和转化科学中心，以协助进行统计分析。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

伦理

麦克风Ë 是根据处理，并安置在美国国立卫生研究院的实验动物资源委员会（https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory -animals.pdf）。阿拉巴马大学伯明翰分校的动物保护与使用委员会每年都会对所有实验方案进行审查和批准（IACUC-21145 ; 于2018 年2月2日首次批准）。

参考文献

Aronov ，D.，Nevers，R.和Tank，DW（2017）。海马-肠胃神经回路绘制的非空间尺寸图。自然543（7647）：719-722。
V.Barros ，VN，Mundim ，M.，Galindo，LT，Bittencourt ，S.，Porcionatto ，M.和Mello，LE（2015）。大鼠和猴子大脑中c-Fos 表达的模式及其不应期。前沿细胞神经科学9：72 。
Bird，CM和Burgess，N。（2008）。海马和记忆：来自空间处理的见解。Nat Rev Neurosci 9（3）：182-194。
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