材料和试剂

1. 384孔板（赛默飞世尔科学公司，应用生物系统公司，目录号：4309849）

2. 15毫升聚丙烯离心管（康宁，目录号：430791）

3. 实验室用滤纸（Sartorius）

4. 1.5ml微型胶管（品牌，目录号：780502）

5. 10毫升注射器（BD，目录号：309110）

6. 0.22μm一次性过滤器（Sartorius，目录号：16532-Q）

7. N、克利夫兰种子在24°C和60%下生长的植物-70%湿度

注：种子来自内部收集。

8. PVY cDNA克隆PVY-N605（123）（Bukovinszki等人，2007）

注：这个 p如有要求，斯洛文尼亚国家生物研究所可提供lasmid。

9. QuikChange II XL定点突变试剂盒（安捷伦科技，目录号：200522）

10. 巴托胰蛋白胨（BD，目录号：211705）

11. 酵母提取物（BD，目录号：212750）

12. 巴氏琼脂（BD，目录号：214010）

13. 氯化钠（默克，苏泊尔公司，目录号：1.06404.1000）

14. KCl（默克，苏泊尔公司，目录号：1.04936.0500）

15. 氯化镁（默克，西格玛，目录号：M8266-100G）

16. 无水葡萄糖（Kemika，目录号：0705007）

17. 氨苄西林（默克，西格玛-奥尔德里奇，目录号：A9393-5G）

18. KAPA2G-Robust HotStart聚合酶与dNTP（Kapa Biosystems，目录号：KK5516）

19. GenEluteTM质粒Miniprep试剂盒（默克，Sigma-Aldrich，目录号：PLN350-1KT）

20. Monarch质粒Miniprep试剂盒（NEB，目录号：T1010）

21. 琼脂糖（默克，西格玛-奥尔德里奇，产品目录号：A9539）

22. 溴化乙锭溶液10 mg/ml（默克，西格玛-奥尔德里奇，目录号：E1510-10ML）

23. Trizma base（Tris base）（默克，Sigma-Aldrich，目录号：T1503）

24. 100%冰醋酸（Merck，Supelco，目录号：1.00063）

25. EDTA（二水二钠盐）（默克公司，Sigma-Aldrich，目录号：E5134）

26. 新鲜100%乙醇（光谱用乙醇，Uvasol®，默克，Sigma-Aldrich，Supelco，目录号：1009800500）

27. 0.05 M亚精胺（默克，Sigma-Aldrich，目录号：S0266-1G）

28. 1 M CaCl（默克，Sigma-Aldrich，目录号：C1016-100G）2

29. MagMAXTM-96总RNA分离试剂盒（Invitrogen，目录号：AM1830）

30. 植物RNA分离辅助剂（Invitrogen，目录号：AM9690）

31. 溶解基质A：含有石榴石和一个1/4“陶瓷球的管（MP Biomedicals，目录号：11691050-CF）

32. 一步法RT-PCR试剂盒（Qiagen，目录号：210210）

33. AgPath ID一步法RT-PCR试剂（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，目录号：AM1005）TM公司

34. NaH2PO42H2O（默克，SAFC，目录号：1.06345.1000）·

35. Na2HPO4（默克，苏普尔科，目录号：1.06586.0500）

36. ddH2O中的1%（w/v）醋酸铀酰（SPI供应，目录号：6159-44-0）

37. S、 O.C.介质（见配方）

38. LB中等液体（低盐）（见配方）

39. 抗生素（见处方）

40. 0.1 M磷酸盐缓冲液（见配方）

41. 50x TAE缓冲液（见配方）

42. 50万EDTA（见配方）

设备

1. 镊子

2. 微量加样器

3. T100TM热循环器（Bio-Rad，目录号：1861096）

4. 水浴WB-13（Kambič，目录号：1201）

5. 培养箱，轨道振动筛SI500（斯图尔特）

6. 琼脂糖凝胶电泳

7. UVP ChemStudio PLUS（Analytik Jena，目录号：849-97-0847-04）

8. NanoDropTM 1000分光光度计（赛默飞世尔科技公司，停产）

9. 桑格测序（Eurofins Scientific）

10. Helios基因枪系统（Bio-Rad，目录号：165-2432），包括：

a、带调节器和管道制备站的氦气软管组件（Bio-Rad，目录号：165-2420）

b、注射器套件、Tefzel导管、切管器、优化套件（Bio-Rad，目录号：165-2424，包括0.6μm、1.0μm和1.6μm金微载体、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、干燥剂、五个药筒储存瓶、50英尺长的Tefzel金色涂层管，用于1000个样本）

11. 氦气罐（Messer，6.0级）

12. 氮气罐（Messer，5.0级）

13. 氮调节器（例如，Bio-Rad，目录号：165-2425）

14. 超声波清洗浴Sonis 3 GT（Iskra Pio）

15. FastPrep-24TM经典仪器（MP Biomedicals，目录号：116004500）

16. 翠鸟仪器（Thermo Scientific，停产）

17. QuantStudio 7 Flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied BiosystemsTM，目录号：4485701）

18. 自动液体处理系统（Microlab STARlet，Hamilton）

19. 透射电子显微镜（Philips，CM 100），配备耦合充电设备相机ORIUS SC 200（美国普莱森顿市加坦公司）

软件

1. 斯内普金(https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/)

2. QuantGenius软件（Baebler等人，2017年，http://quantgenius.nib.si/user/login)

3. 数字显微照片，版本2.11.1404.0（Gatan Inc.，Pleasanton，USA）

程序

A、克隆基因制备PVY突变cDNA克隆

在步骤A中，将突变导入PVY质粒的期望位置，然后将突变质粒转化为，并通过菌落PCR对引入的突变进行确认。最后，突变质粒和WT质粒在被引入植物之前被增殖和纯化。大肠杆菌

1. 使用QuikChange II XL定点突变试剂盒（安捷伦技术）通过定点突变将突变引入质粒（PVY cDNA克隆PVY-N605（123），Bukovinszki等人，2007）。

a、设计突变引物（如缺失）。

i、期望的突变应该在引物的中间。

二。最低GC含量应为40%。

iii.以一个或多个C或G基终止。

iv.底漆长度应为40-50个碱基。

v、底漆的熔化温度（Tm）≥78°C（Tm计算：81.5+0.41（%GC）–（675/N）；N是底漆在基底中的长度，不包括正在插入或删除的基底。

六、高效液相色谱法纯化。

七。提供了一个设计前向引物以在PVY-CP的C端引入60个氨基酸残基的缺失的示例（图1）：

前向引物（不包括待删除的核苷酸）退火至亲本质粒，在待删除的亲本质粒区域形成发夹。这将产生一个扩增片段，其中包含PCR后所需的缺失。

图1。使用SnapGene viewer设计正向引物的一个示例

b、用表1中规定的试剂和如下所示的循环程序建立PCR反应。

表1。致突变PCR反应组分

试剂

最终浓度或体积

水

变量

10x反应缓冲液

1倍

dNTP混合物

0.5微升

寡核苷酸前向引物

0.5微米

寡核苷酸反向引物

0.5微米

疑问解

1.5微升

质粒（大质粒：14kbp）

200纳克

PfuUltra-HF-DNA聚合酶

1微升

总体积

25微升

热循环器条件

92°C 2分钟

92°C 50秒

10个周期

65°C至55°C 50秒，着陆

68°C 2分钟/kb

92°C 50秒

8个周期

55°C 50秒

68°C 2分钟/kb

68°C 60分钟

2. 用QuikChange II XL定点突变试剂盒中的DpnI酶消化未修饰的质粒。每25µl反应使用4µl酶，在37°C下培养2小时。

3. 转化大肠杆菌XL10金超能力细胞（包含在QuikChange II XL定点突变试剂盒中）：

a、在冰上轻轻解冻XL10金超能力细胞。将45μl超活性细胞等分到2 ml试管中，以进行每个样品反应。

b、向45μl细胞中添加2μlβ-ME混合物（随试剂盒提供）。

c、轻轻搅拌。在冰上培养细胞10分钟，每2分钟轻轻搅拌一次。

d、将2μl DpnI处理过的DNA转移到每个超能力细胞的小份上。

e、轻轻混合转化反应，在冰上孵育30分钟。

f、在42°C水浴中热冲击管30秒。热冲击的持续时间对于获得最高效率至关重要。

g、在冰上培养试管2分钟。

h、将0.5 ml预热（42°C）S.O.C.介质添加到每个管中。

i、在37°C下培养1小时，以225-250转/分的转速摇晃。

j、将每个转化反应的整个体积（250µl x 2个板）置于含有适合质粒的抗生素（例如氨苄西林）的LB琼脂平板上。

k、将培养皿在37°C下培养过夜。

4. 使用KAPA2G稳健热启动PCR试剂盒（Kapa Biosystems）建立菌落PCR。

a、在50µl无菌ddH2O中再培养5个转化菌落。

b、使用1µl菌落悬浮液制备菌落PCR。

注：将剩余的菌落悬浮液保存在4°C；用于制备阳性菌落的过夜培养物。

c、用表2中规定的试剂和如下所示的循环程序建立PCR反应。

注：同时扩增非突变质粒（10 ng/µl)作为对照。

表2。菌落PCR反应组分

试剂

最终浓度或体积

水

变量

5x KAPA2G缓冲液B

1倍

10mm KAPA dNTP混合料

每个0.2 mM

5'PCR引物（突变上游）

0.3微米

3'PCR引物（突变下游）

0.3微米

KAPA2G稳健热启动DNA聚合酶（5u/μl）

库存0.3件

菌落悬浮液（50µl）

1微升

总体积

10微升

热循环器条件

95°C 5分钟

95°C 30秒

30个周期

Tm°C 15秒

72°C 1分钟/Kb

72°C 5分钟

d、将1µl每个PCR产物（也包括未突变的质粒）加载到1%琼脂糖凝胶上，在1x TAE缓冲液中用溴化乙锭（最终浓度0.5µg/ml）制成。

e、对于有突变的菌落（在凝胶上观察到变化，见图2），将5µl菌落悬浮液添加到含有抗生素（例如氨苄西林）的5 ml LB液体培养基中。

图2。琼脂糖凝胶显示有缺失的菌落。 1：非突变质粒；2-8：有缺失的菌落；Mw：分子量；bp：碱基对。

f、在37°C下培养16-18小时，以200-250 rpm的转速振荡。

5. 使用GenEluteTM质粒Miniprep试剂盒（Sigma）分离质粒，遵循制造商的说明，稍加修改：

a、在室温下以4500转/分的转速离心5毫升过夜培养液于15毫升猎鹰管中离心5分钟。

b、洗脱步骤：

向旋转柱中添加30µl无核酸酶的水。室温下孵育10分钟。当温度≥70 kb或质粒温度≥20℃时，分别使用。在室温下以最高速度离心2分钟。

6. 用NanoDropTM 1000分光光度计测量质粒浓度。预期收率范围为1.5-4.5µg，指示剂比率A260/A230和A260/A280的预期纯度范围分别为1.8-2.4和1.8-2.1。

7. 发送样品进行Sanger测序，以确认正确的序列（公司：Eurofins Scientific）。在突变位点上游使用5’PCR引物，在突变位点下游使用3’PCR引物。获得的序列在氨基酸水平上应与预期序列（包括计划的修改）完全相同。沉默突变是可以接受的。

8. 在确认序列后，使用相同的方法并结合5-10个mini、midi或maxi preps制备50µg每个质粒。

注：对于质粒分离，也可以使用Monarch质粒Miniprep试剂盒（NEB，见快速协议卡）。

B、利用Helios基因枪系统（Bio-Rad）进行生物攻击，用PVY基因克隆（WT和突变）感染植物

在这里，金纳米粒子有助于将质粒转移到植物体内。首先，质粒与金纳米粒子结合，然后将质粒结合的纳米金颗粒装入基因枪管。将药盒插入基因枪，将质粒结合的金纳米粒子射入植物叶片组织。

1. 将质粒DNA沉淀到微载体上。

a、在100%乙醇中制备20 mg/ml PVP储备溶液。用100%乙醇稀释此溶液，制备3 ml浓度为0.05 mg/ml的PVP溶液。不使用时，请将这些溶液盖紧。仅使用新制备的稀释液。

b、在1.5 ml微胶囊管中称取金微载体（金颗粒大小：0.6µm，使用6.25 mg/质粒）。

c、将0.05 M亚精胺添加到试管中的6.25 mg金中。0.05 M亚精胺的体积应等于50µg质粒的体积。

d、将金和亚精胺混合物搅拌几秒钟，然后用超声波清洗浴进行超声波处理3-5秒，以粉碎金团块。

e、向金和亚精胺混合物中添加50µg质粒。

f、将DNA、亚精胺和金搅拌约5秒。

g、在以中等速率旋转混合物的同时，逐滴向混合物中添加1 M CaCl2。加入量应等于质粒的体积。整个混合物（金、亚精胺、质粒和CaCl2）的最大体积不得超过1200µl。

h、让混合物在室温下沉淀10分钟。

i、现在大部分的黄金都会在小球里，但也有一些可能会留在管子的侧面。将微载体溶液旋转（10000转/分）在微夹具中旋转约30秒，使金颗粒化。丢弃上清液。

j、在剩余的上清液中通过短暂的漩涡使小球重新悬浮。每次用1ml新鲜100%乙醇清洗小球三次，如果发现金颗粒聚集，则进行超声波检测（仅需短时间以避免DNA损坏）；每次清洗之间，在微型夹具中旋转约30秒。丢弃上清液。

k、在最终乙醇洗涤后，在含有0.05 mg/ml PVP（在步骤B1a中制备）的200µl乙醇溶液中重新悬浮颗粒。将悬浮液转移到带有螺帽的15ml一次性聚丙烯离心管中。用200µl相同的乙醇/PVP溶液冲洗微型食品管，并添加到15 ml离心管中。再次冲洗，直到所有的黄金都从试管中被冲洗干净。向15 ml离心管中加入3 ml乙醇/PVP溶液。

2. 药筒的制备

a、使用试管制备站将DNA/微载体悬浮液装入金涂层管中。

i、在制备滤筒之前，用氮气吹扫确保镀金管完全干燥。将未切割的管子插入管子制备站。将油管制备站连接至氮气罐。使用油管制备站流量计上的旋钮，打开氮气并将流量调节至0.3-0.4 LPM（升/分钟）。在以下步骤中使用之前，让氮气流过镀金涂层管至少15分钟。

二。从油管制备站取下镀金油管。

iii.使用流量计上的旋钮关闭流向油管制备站的氮气流量。

iv.切割一根干燥的镀金油管，长度为油管站加10厘米。将金涂层管的一端插入安装在10毫升注射器上的转接管末端。

v、对微载体悬浮液进行涡流处理，如有必要，进行短暂的超声处理，以获得均匀的金悬浮液。将管子倒置几次，以重新消耗黄金。立即取下盖子，并迅速将金悬浮液吸入金涂层管中，以覆盖管道。避免将气泡吸入金涂层管道。从悬架上拆下油管，并继续将悬架拉入油管中约3厘米，以便在两端留出一些空间。切断浸泡在液体中的管子部分，以避免污染制管站。

vi.立即将金涂层管置于水平位置，并将装有注射器的加载管滑入油管制备站的油管支撑筒中，直到油管穿过O型环。

七。让微载体静置5分钟。

八。以1-2 cm/s的速度缓慢向外拉动注射器柱塞，以除去乙醇。

ix.将注射器从镀金管上取下，并在管端附加一个一次性过滤器（0.2µm）。在凹槽中，立即将镀金管转动180°，并让金涂层开始在管子内表面上涂层3-4秒。

x、开始旋转油管制备站。让金在管内扩散20-30秒，然后打开流量计上的阀门，让0.35-0.4 LPM的氮气干燥镀金管，同时继续旋转。

席。继续干燥镀金管，同时旋转5分钟。

十二。关闭油管制备站电机。关闭流量计上的阀门，关闭氮气。

十三。从油管支撑油缸上拆下油管。

b、使用切管器准备药筒。将药筒储存在含有干燥剂颗粒的药筒储存小瓶中。

3. 用基因枪轰击。

a、实验装置：

i、使用克利夫兰6-10叶期的植物。

二。轰炸七个植物（每株植物五片叶子）为一个构造。

iii.使用黄色荧光蛋白表达质粒或其他缺少任何PVY相关序列的质粒作为阴性轰击对照（以检查在轰击过程中由于PVY携带而产生的任何背景信号）。

四、野生型病毒应始终最后使用，以轰炸叶片（以避免污染）。

b、轰炸：

笔记：

（一）使用一次性外套和眼镜，在有紫外线的室内工作。

（二）轰击后，在进行下一个质粒前，用DNA去除剂仔细清洁，并打开试管中的紫外线灯。

i、准备基因枪：插入电池，拧紧枪上的枪管衬套，将枪管O型环插入枪管衬套。

二。将枪连接到氦罐（完全打开第一个阀门，并将第二个阀门的压力设置为200 psi）。

注：第一次轰炸后，检查压力是否仍为200 psi。

iii.用墨盒填充墨盒支架（使用镊子）。

四、将枪托插入枪内（打开所有锁），在顶部设置12号，按下气缸推进杆（如图3所示）。

图3。Helios基因枪的部件和控制装置（Helios基因枪系统手册）

v、用枪（带枪管衬）触碰叶片，按住安全联锁按钮，按下触发按钮轰击叶片（见图4）。按下油缸前进操纵杆以切换到新墨盒。

在每株植物的5片叶子上重复该程序。

图4。植物叶片的轰击

c、在快速准备管中收集材料。

i、在轰击后7天，每株植株分别收集三片被轰击的叶子，并立即在液氮中冷冻。

二。用同样的方法，在轰击后14天取样系统感染的叶片。

C、 PCR分析（在植物中对病毒进行扩增后）

在这里，总RNA是从被突变体PVY克隆轰击的植物叶片中纯化出来的，并且通过经典的RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳证实了病毒后代中引入突变的存在。然后，用PVY通用RT-qPCR法对WT和突变病毒克隆轰击植物的病毒载量进行相对定量。

1. RNA分离

a、使用MagMAX-96总RNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）。RNA可以用磁性支架和96孔板的摇床手动分离，也可以用翠鸟仪器（Thermo Fisher Scientific）自动分离。

b、按照制造商关于匀浆制备的说明进行修改：向每个冷冻叶片中添加450µl裂解结合溶液浓缩液和50µl植物RNA分离助剂，并立即使用FastPrep仪器（6 m/s，60 s）开始均质。完全均匀化后，以14000 x g离心分离样品10分钟。丢弃颗粒。将50μl均质样品转移到处理板的孔中，并遵循制造商的协议。

c、包括提取过程的阴性对照。

d、最佳RNA产量范围为1-9µg，指示比A260/280和A260/230的最佳纯度范围分别为1.7-2.2和1.0-2.1。根据我们的经验，不在这些范围内的值也会产生最佳的qPCR结果。

2. 建立经典的一步RT-PCR方法，用Qiagen-one-step RT-PCR试剂盒，确认导入的突变在植物病毒后代中保持不变。使用表3中规定的试剂和如下所示的循环程序。将PCR产物装载在1%琼脂糖凝胶上，琼脂糖凝胶在1x TAE缓冲液中制成，溴化乙锭（最终浓度为0.5µg/ml）。检查琼脂糖凝胶上的位移，以确认突变。

表3。一步法RT-PCR反应组分的研究

试剂

最终浓度或体积

无核糖核酸酶H2O

变量

5x桥根一步法RT-PCR缓冲液

1倍

dNTP混合物（每个dNTP包含10 mM）

每个dNTP 400µM

5'PCR引物（突变上游）

0.6微米

3'PCR引物（突变下游）

0.6微米

桥根一步法RT-PCR酶联用

1微升

核糖核酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific:20 U/µl）

1微升

模板RNA（50–100 ng）

1微升

总体积

25微升

热循环器条件

50°C 30分钟

95°C 15分钟

94°C 30秒

35个周期

Tm°C 30秒

72°C 1分钟/Kb

72°C 10分钟

3. 使用AgPath IDTM一步法RT-PCR试剂盒（Thermo Fisher Scientific）建立qPCR反应（单步定量RT-PCR）。

a、量化PVY-N605病毒。

i、以CP为靶点的扩增子检测PVY克隆（PVY）和细胞色素氧化酶（COX）作为内源性对照（见表4中的引物和探针）。

注：确保PVY克隆的扩增子不在引入突变的位置（例如，缺失）。这个扩增子量化WT病毒和突变体，并使他们的比较。

表4。COX和PVY扩增子的引物和探针

姓名

序列（5'至3'）

集中

参考文献

考克斯

正向PCR引物

CGTCGCATTCAGATTATCCA公司

0.9微米

反向PCR引物

0.9微米

Weller等人，2000年

TaqMan®探头

FAM-TGCTTAGCTGGAGGAATGCCCT-TAMRA公司

0.2微米

PVY公司

正向PCR引物Cataggaaactgaaaatgccaact

0.3微米

Kežar等人，2019年

反向PCR引物

tggcaggttcatttcca

0.3微米

Kogovšek等人，2008年

TaqMan®探头

FAM-TGATGGGCTTAGGTTTGGTGCA-TAMRA公司

0.15微米

Kogovšek等人，2008年

二。用表5所示试剂和以下循环条件建立一步定量RT-PCR。

表5。一步定量RT-PCR反应组分的研究

试剂

最终浓度或体积

无核糖核酸酶H2O

变量

2x RT-PCR缓冲液

1倍

正向PCR引物

见表4

反向PCR引物

见表4

TaqMan®探头

见表4

25x RT-PCR酶混合物

0.2微升

模板cDNA（10倍稀释，两次重复）

2微升

总体积

5微升

热循环器条件

48°C 10分钟

95°C 10分钟

95°C 15秒

40 周期

60°C 1分钟

b、制备标准曲线：合并每个样品2µl。稀释5x、25x、125x和625x。

c、包含非模板控件。

d、如果使用自动液体处理站将移液管移到384孔板上，两次技术复制就足够了，否则，建议使用三次。

e、 RT-qPCR可同时检测病毒RNA和残留质粒DNA。为了只定量病毒RNA，必须消除质粒衍生信号对PVY-RNA浓度的贡献。为了检测任何质粒衍生的信号，对每个样本进行不含RT的qPCR反应。为此，在qPCR反应之前，将25x RT-PCR酶混合物在95℃下加热10分钟，使AgPath ID一步法RT-PCR试剂盒中的RT酶变性。为了计算病毒RNA的数量，从总信号中减去质粒衍生信号（病毒RNA+质粒DNA）（见数据分析，步骤2）。

f、用quantGenius软件计算PVY-RNA的相对拷贝数(http://quantgenius.nib.si/user/login，Baebler等人，2017），见数据分析。

D、透射电镜观察样品及图像采集

在这里，用电子显微镜观察野生型和变异病毒克隆轰击植物叶片的提取物，以观察病毒离子的形成。

1. 在轰炸后7天，切下3-4片（1-2 mm2）克利夫兰的下部叶片，将其放入Eppendorf管中，并用300µl 0.1 M磷酸盐缓冲液浸渍。

2. 在一滴样品上放置一个涂有碳纤维的网格5分钟。

3. 用滤纸小心地触摸网格边缘，将样品浸透，并用5-10滴去离子水冲洗网格。

4. 用一滴1%（w/v）醋酸铀酰对样品进行染色。

5. 立即用滤纸触摸格栅边缘，去除多余的醋酸铀酰。

6. 在室温下干燥样品。

7. 用透射电子显微镜观察网格，并用一对带电设备相机获取图像（图5）。

8. 使用数字显微摄影软件处理图像。

图5。克隆PVY-N605（123）轰击叶片的负染透射电镜观察。 PVY-N605（123）弯曲病毒由箭头指示。

数据分析

1. 在轰击过程中，检查是否有因PVY携带而产生的背景信号（来自表达黄色荧光蛋白质粒的植物的病毒RNA）。所有Cq（循环量化）值高于背景值的样本（例如，Cq=32）应视为阴性。

2. 用quantGenius软件计算PVY-RNA的相对拷贝数(http://quantgenius.nib.si/user/login，Baebler等人，2017年）。利用该软件，利用标准曲线计算相对基因定量。输入Cq-s作为参考基因（COX），并将提取质量控制设置为28。Cq值<28表示有效的RNA提取。然后输入目标基因的Cq-s（PVY-n605cp）。软件的最终输出是每个样本的质量控制相对拷贝数。从RT-qPCR计算的拷贝数中减去不含RT（样品中存在质粒DNA）的拷贝数。最后的结果是病毒RNA的相对拷贝数。

3. 用Bonferroni事后分析进行单向方差分析，以统计评估PVY克隆之间病毒积累的差异。P值小于所选值表明各组之间存在显著差异。事后分析揭示了哪些PVY突变体的积累方式不同于WT-PVY。每组至少包括20个样品（即7株植物和3片叶子），并至少进行两次完整的实验。

食谱

1S、 O.C.介质1S、 O.C.介质

成分量/L

巴托胰蛋白胨20 g

酵母抽提物5g

氯化钠580毫克

氯化钾186毫克

氯化镁952毫克2

葡萄糖3.603克

将pH值设置为7.0

在121°C下高压灭菌15分钟

2. LB中等液体（低盐）

组件金额/L

巴托胰蛋白胨10 g

酵母抽提物5g

氯化钠5克

设置为pH值7.5

LB琼脂（1L）：在LB培养液中加入15g巴氏琼脂

在121°C下高压灭菌15分钟

3. 抗生素

抗生素最终浓度（µg/ml）

氨苄西林100

使用0.22μm一次性过滤器进行过滤消毒

4. 1.0 M磷酸盐缓冲液

组件用量/100毫升

NaH2PO4·2H2O 6.24克

Na2HPO4 7.50克

将pH值设置为6.8

5. 50x TAE缓冲器

组件金额/L

Trizma base 242克

乙酸57.1毫升

0.5 M EDTA 100.0毫升

向4900 ml dH2O中加入100 ml 50x TAE缓冲液，以获得1x TAE缓冲液

6. 0.5百万EDTA

成分量/L

二水合EDTA二钠盐186.1 g

将pH值设置为8.0

致谢

这项工作得到了斯洛文尼亚研究机构的支持（P1-0391、J7-7248、P4-0165、P2-0145和P1-0010，A.K.博士学位）。

我们感谢研究论文Kežar（2019）和J.Lenarčič、M.Srnko、L.Mourrain、M.Kisovec、A.Blejec、B.Dušak和R.Vollmeier的所有作者的支持，并感谢F.Cillo对PVY克隆的支持。Dobnik（2013）对生物轰炸方案进行了调整和优化。等等。等等。

相互竞争的利益

作者声明作品中没有利益冲突。

工具书类

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