材料和试剂

盖玻片（24 x 40 mm）（Thermo Fisher Scientific ，目录号：125485J ）（在边缘用3％的二氯二甲基硅烷在乙醚中硅化，图1C）
注意：应使用非涂层的盖玻片，因为使用涂层的盖玻片会导致细胞附着在盖玻片的表面。

直径为3.5厘米的未经处理的塑料皿（Iwaki，目录号：1000-035 ）
玻璃毛细管
水稻卵细胞，精子细胞和受精卵（图1D，1E和1G）
注意：稻植物（水稻品种日本晴。或CV 雪光）在26生长的环境室中℃下在13/11小时光照/黑暗周期，150-300光合光子通量密度微摩尔光子/ m 2 /秒。在这些生长条件下，整个季节都可以获得穗。稻卵细胞和精子细胞是根据Toda等人所述的完整方法分离的。（2016）。如同一方案中所述，也可使用电融合来制备水稻合子。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902648--1439户田惠梨香771895 \图jpg \图1.jpg

图1. 用于细胞操作（AC）以及制备分离的配子和体外合子（DG）的设备和材料。A.滑动台，用于插入盖玻片和塑料皿。B.玻璃毛细管连接的处理进样器。白色箭头表示玻璃毛细管。C.硅化盖玻片上矿物油内部的液滴图像。D.分离的卵卵细胞。E.分离的水稻精子细胞（黑色箭头）。F.使用连接到电融合设备的电极对卵细胞和精子细胞进行电融合的图像。G.电融合产生的水稻合子。规模b AR 小号= 5厘米A，20微米d和G，和15微米的E.

饲养细胞：水稻悬浮细胞培养物（Line Oc ，由日本筑波市理研生物资源中心提供）
注：水稻悬浮细胞，行的Oc ，进行传代培养根据来自RIKEN生物资源中心的指令，每周一次。在新鲜传代培养的细胞和1周培养的细胞之间，饲养者的作用没有差异。

甘露醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录编号：133-00845 ）
370 mosmol / kg H 2 O（330 mM）甘露醇溶液（高压灭菌）
450 mosmol / kg H 2 O（385 mM）甘露醇溶液（高压灭菌）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5310-100ML ）
无水乙醇（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：057-00451 ）
二氯二甲基硅烷（东京化学工业，目录号：D0358 ）
乙醚（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：055-01155 ）
氯化镁2· 6H 2 O （FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：135-00165 ）
CaCl 2 · 2H 2 O（FUJIFILM Wako Pure Chemical，目录号：038-19735）
一水合2-巯基乙烷磺酸（MES，C 6 H 13 NO 4 S · H 2 O，Dojindo ，目录号349-01623 ）
聚乙二醇4 00 0 （西格玛奥德Ardrich ，目录号：81240-1KG ）
单向导RNA（使用GeneArt Precision gRNA合成试剂盒合成）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A29377 ），存储-80 °C
Cas9蛋白（Thermo Fisher Scientific，GeneArt Platinum Cas9核酸酶; Thermo Fisher Scientific，TrueCut Cas9 Protein v2，目录号：A36496），储存-20 °C
基于tRNA的多重CRISPR-Cas9载体（pMgPoef4_129-2A-GFP;登录号LC460477）
合子培养基，储存4 ℃
再生介质，存储4 °C
生根介质，存储4 °C
注意：合子培养基，再生培养基和生根培养基的配方见Toda等。（2016）。

PrepMan Ultra（Thermo Fisher Scientific，目录号：4318930）
PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（宝酒，目录号：R050A）
ExoSAP -IT Express PCR纯化试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：75001.200.UL）
零钝PCR克隆试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K270020）
MMG解决方案（请参阅食谱）
PEG-Ca 2+ 溶液（请参阅配方）
注意：MMG溶液和PEG-Ca 2+ 溶液应新鲜制备，因为使用旧溶液会降低PEG-Ca 2+的转染效率。

设备

镊子
倒置显微镜（OLYMPUS，型号：IX-71或IX-73）
插入盖玻片和塑料皿的滑动台（图1A）
手动进样器（PrimeTech ，HDJ-M3，图1B ）
用50μl 吸管制成的玻璃毛细管（Dru mmond Scientific，目录号：2-000-050）（图1B）
注意：Toda等人介绍了制造玻璃毛细管的程序。（2016）。

电融合器（Nepa Gene，型号：ECFG21）
机械手（NARISHIGE，型号：M-152），带有双移液器支架（Narishige ，型号：HD-21）
固定在移液器支架上的电极（Nepa Gene，型号：CUY5100Ti100）（图1F）
Millicell -CM刀片，直径12毫米（EMD Millipore，目录号：PICM01250）
环境室
用于合子培养的振荡器（EYELA，型号：Multi Shaker MMS-3020）
渗透压仪（Gonotec ，型号：Osmomat 3000 basic）

软件

Focas网络工具（Focas UI，http：//focas.ayanel.co/ ）
RNA折叠表格软件（mfold Web服务器，http : //unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/ RNA-Folding- Form2.3 ）
GENETYX软件（GENETYX）中的并行编辑器
SnapGene Viewer（SnapGene ）

程序

质粒DNA PEG-Ca 2+ 转染水稻卵细胞
用质粒DNA进行稻卵细胞PEG-Ca 2+ 转染的程序概述如图2A所示。
如图2C和2D所示，准备0.5-1滴液滴的甘露醇溶液，MMG溶液，包含质粒DNA（MMG-DNA，80-320 ng / µl）的MMG溶液和PEG-Ca 2+ 溶液）。
笔记：

我们的研究表明，含有较高质粒浓度（约270-320 ng /μl）的MMG-DNA溶液通常可产生有效的瞬时表达（Koiso 等人，2017）。
为了制备MMG溶液和PEG-Ca 2+ 溶液，请使用渗透压计将甘露醇溶液的渗透压调节至370 mol / kg H 2 O（330 mM ）和450 mosmol / kg H 2 O（385 mM ），用于米卵细胞和受精卵，分别。
如果所制备的质粒DNA样品的浓度较低，并且在制备MMG-DNA溶液（80-320 ng / µl）时，质粒DNA的流体体积超过MMG溶液的体积，则使用2x MMG溶液（两倍浓度）被推荐。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902648--1439 Erika Toda 771895 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.程序PEG-的Ca 2+ 稻卵细胞（A）和合子（B），用于制备PEG-钙化学溶液滴中的转染2+ 时或之后（C和d）的转染，和水稻卵细胞PEG-Ca 2+ 处理（E）。A. 用质粒DNA对水稻卵细胞进行PEG-Ca 2+ 转染的程序说明。将转染的卵细胞培养在装有合子培养基的液滴或Millicell 插入物中，以观察和分析瞬时基因表达对细胞的影响。B. 用质粒DNA对水稻合子进行PEG-Ca 2+ 转染的方法的图解。将转染的合子在装有合子培养基的Millicell 插入物中培养，以观察和分析瞬时基因表达对合子发育的影响。C和D。硅化盖玻片上矿物油中用于PEG-Ca 2+ 转染的每滴液滴的照片（C）和图像（D）。甘露醇，甘露醇溶液；MMG，MMG解决方案；MMG +大分子，含有质粒DNA或核糖核蛋白的MMG溶液；PEG，PEG-Ca 2+ 溶液。E.MMG-DNA和PEG-Ca 2+ 溶液合并的液滴（左图）或甘露醇溶液（右图）中的水稻卵细胞。PEG-Ca 2+ 处理后卵细胞萎缩，处理后在甘露醇溶液中恢复卵细胞大小。在A和B中，粉红色，绿色和橙色圆圈分别表示卵，精子和合子核。A和B中的黄色闪电和灰色环分别指示电融合点和质粒DNA。在d中，箭头指示的程序小号用于在转移细胞进入每个液滴PEG-的Ca 2+ 的转染。MMG + 大分子和PEG液滴上方的弯曲箭头指示在S tep A6 中合并和混合两个液滴的过程。刻度b ars =在C中为1 cm，在E中为20 µm。

将大约三到六个从稻花中分离出的卵细胞转移到0.5-1滴甘露醇溶液（370 mosmol / kg H 2 O）中，并用玻璃毛细管在盖玻片上覆盖矿物油（图2D）。
将细胞转移到盖玻片上的MMG溶液小滴中，将细胞洗涤两次。
注意：由于细胞倾向于附着在MMG溶液小滴中的盖玻片表面，因此，应使用位于盖玻片底部稍上方的玻璃毛细管类型来操作MMG溶液小滴中的吸取和释放细胞。。

将细胞转移到MMG-DNA液滴中（视频1）。

视频1.用MMG溶液冲洗卵细胞，方法是将细胞转移到MMG小滴中，然后将细胞转移到MMG-DNA小滴中

使用玻璃毛细管将MMG-DNA小滴（其中转移了细胞）与一小滴PEG-Ca 2+ 溶液合并（图2D；视频2）。然后立即伊利和绅士用玻璃毛细管约1分钟混合LY合并液滴。
注意：尽管当MMG-DNA小滴与PEG-Ca 2+ 溶液合并时，细胞通常会漂浮在混合溶液中，但是在培养过程中，这些细胞会逐渐沉入溶液中。

视频2.混合装有玻璃蛋的MMG-DNA小滴与PEG-Ca 2+ 溶液小滴，用玻璃毛细管混合

在室温下孵育5分钟。在本文中，可以观察到细胞收缩（图2E）。
孵育后，通过将甘露醇溶液添加到合并的液滴中，用甘露醇溶液替换包含MMG-DNA和PEG-Ca 2+ 溶液的混合溶液，并使用玻璃毛细管轻轻混合液滴。
吸出约的混合溶液的一半体积，使用玻璃毛细管RY （视频3）。

视频3. 用甘露醇溶液代替MMG-DNA和PEG-Ca 2+ 混合溶液。将甘露醇溶液添加至MMG-DNA和PEG-Ca 2+ 混合溶液的液滴中，然后使用玻璃毛细管将液滴轻轻混合。此后，从液滴中除去溶液的大约一半的体积。

重复步骤A9和A10五至六次，以降低存在PEG-Ca 2+ 处理的细胞的液滴中MMG和PEG-Ca 2+ 的浓度。在此过程中，缩小的单元格将恢复其初始圆形形状（图2E）。
将处理过的细胞转移到新鲜的甘露醇溶液中（图2D）。
用玻璃毛细管将细胞转移到新鲜甘露醇溶液（450 mosmol / kg H 2 O）的液滴中，洗涤细胞三到四次。
将细胞转移到受精卵培养基的液滴与几个聚集吨的他饲养细胞（图3A，中岛等人。，2010）或成合子培养基在Millicell小插入物相的几个聚集一滴（约50微升）饲养细胞（图3B）。
注意：液滴中处理过的卵细胞的培养非常适合于短期观察和分析（大约1-2天）。对于长期培养（超过2-3天），一个细胞培养皿建议文化（见P rocedure B）。

将卵细胞在黑暗中于26 °C在黑暗中培养适当的时间，并进行细胞分析。
注意：在我们的研究中，以小滴培养的转染卵细胞在转染后约1天表达GFP和DsRed2荧光信号，这些信号来自转染到细胞中的质粒DNA。此外，当我们转染的稻卵细胞用质粒DNA携带OsASGR-BBML1，在培养的经处理的细胞细胞培养皿发起围绕转染后2天的核/细胞分裂（小矶等人，2017; Rahman等，2019）。

质粒DNA PEG-Ca 2+ 转染水稻合子
用质粒DNA进行水稻合子的PEG-Ca 2+ 转染的程序概述如图2B所示。
对于PEG-Ca 2+ 转染，在电融合后1小时内使用IVF产生的水稻受精卵。
注意：由于配子融合后通常在合子质膜周围开始形成细胞壁，因此应将认为细胞壁未成熟的早期合子用于PEG-Ca 2+ 转染。

的PEG-的Ca 2+ 大米合子转染作为步骤A2-A11进行，不同的是甘露醇溶液调节至4 50 mosmol / kg的ħ 2 的O-代替37 0 mosmol / kg的ħ 2 O.
为了在Millicell 插入物中培养PEG-Ca 2+ 转染的受精卵，请将0.2 ml受精卵培养基置于Millicell -CM插入物中，然后将其放入包含2 ml培养基的3.5 cm塑料皿中。向培养皿中加入40-60 µl的水稻悬浮细胞培养物作为饲养细胞（图3B）。
用玻璃毛细管将转染的合子转移到新鲜甘露醇溶液（450 mosmol / kg H 2 O）的液滴中，洗涤三到四次。
将转染的受精卵转移到步骤B4中制备的Millicell 插入物的膜上（图3B）。

PEG-Ca 2+ 转染合子的培养
将合子在黑暗中于26 °C在黑暗中过夜培养后，不需振摇，继续轻轻摇动（40 rpm）进行培养（图s 3C - a和3C - b）。
融合后5到7天，通过将含有胚的Millicell 皿转移到装有2 ml新鲜受精卵培养基的新的35 mm直径皿中，并除去上述饲养细胞，以除去饲养细胞（图3C - c ）。
培养大约18-20天后，通过使用无菌镊子，将Millicell中转染的受精卵发育成的亚培养细胞集落插入塑料皿的再生培养基中。在28 / C 下13/11 h光照/黑暗周期下孵育大约15-30天（图3C - d）。
将带有再生芽的愈伤组织转移到塑料皿中的生根培养基中，并在28 / C 下在13/11 h光照/黑暗循环下培养约15天（图3C - e）。
将产生的小植株转移到土壤中并在环境箱中生长。如果需要，从再生植物中收获种子（图3C - f）。
注意：在我们的研究中，大约60％-70％的PEG-Ca 2+ 转染合子生长并再生为小植株。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902648--1439 Erika Toda 771895 \ Figs jpg \图3.jpg

图3.液滴中的卵卵细胞和受精卵的培养物（A）和微囊插入物（B），以及水稻受精卵的发育概况（C）。A.在带有饲养细胞的合子培养基液滴中的水稻卵细胞培养方法的图解。培养物B.一个例证用于在稻卵细胞或合子方法细胞培养皿插入件。C.水稻合子的发育概况。融合后2小时的合子。b。融合后3天的球状胚状结构。C。融合后10天的细胞团。d。融合后25天的白色愈伤组织。e。在再生培养基中亚培养23天后（融合后47天），带有再生芽的愈伤组织。F。在生根培养基中用再生芽将愈伤组织传代培养17天后的小植株（融合后63天）。比例尺= 20 μ 米并且a和b，c和50微米，并且d 1mm时，在2mm和1厘米，和e和f。

通过将CRISPR-Cas9载体直接递送至受精卵而在水稻中进行基因组编辑
使用Focas网络工具选择目标基因上的靶序列。
在Focas网络工具的“ on_target_score_calculator ”中，上传基因组文件（IRGSP-1.0_genome.fasta）并添加目标基因组序列信息（最高1 kbp ）以获得gRNA目标序列的候选对象（20 mer ）。
选择gRNA靶序列（on_target_score ：大于0.4，无poly T序列）（图4）。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902648--1439 Erika Toda 771895 \ Figs jpg \图4.jpg

图4. Focas网络工具发现的候选gRNA靶序列

将选定的带有PAM序列的gRNA序列放入Focas网络工具的“ CasOT ”中，以进行脱靶搜索。选择显示低脱靶得分的gRNA序列。
使用可从mfold Web服务器获得的RNA Folding Form软件，预测包含所选gRNA序列的单向导RNA（sgRNA）的二级结构。
注意：如果对sgRNA二级结构的预测表明将通过靶序列区域中的互补结合形成茎环结构，则建议避免选择sgRNA，因为靶向效率的差异很可能是由于指导序列的二级结构（Jensen et al 。，2017）。

靶序列的选择之后，准备窝藏CRISPR-Cas9表达CASS的载体等Te作为下方。
注意：在我们的研究中，将用于单个和多重gRNA表达的基于tRNA的多重CRISPR-Cas9载体（pMgPoef4_129-2A-GFP；登录号LC460477）用于基因组编辑。简而言之，该载体具有一个经密码子优化的化脓性链球菌Cas9（OsCas9）序列，该序列在泛素启动子的控制下通过自切割的2A肽与GFP融合，并在OsU3基因启动子的控制下带有tRNA-gRNA单元。。载体构建的细节在Toda等人，J.Biol.215：403-10中描述。（2019）。

要构建用于单基因组编辑的tRNA-gRNA单元，请使用特定引物通过PCR扩增靶序列，以获得包含tRNA和gRNA支架序列的人工基因。
注意：有关特定引物的信息在Toda等人（2007年）中有所描述。（2019）。

要构建用于多重基因组编辑的tRNA-gRNA单元，请使用特定引物通过PCR扩增tRNA-gRNA1-tRNA-gRNA2序列，以获得包含tRNA和gRNA支架序列的人工基因。
注意：有关特定引物的信息，请参见Toda等。（2019）。

使用金门克隆方法（New England Biolabs）将扩增的靶序列或tRNA-gRNA片段插入CRISPR-Cas9多重载体的BsaI 位点。
根据步骤B，通过PEG-Ca 2+ 转染将产生的CRISPR-Cas9载体递送到水稻合子中。
如步骤C中所述培养转染的受精卵。

通过直接将Cas9-gRNA核糖核蛋白递送到受精卵中来编辑水稻中的基因组
根据步骤D1-D5选择每个靶基因上的靶序列。
根据生产商的说明（Thermo Fisher Scientific），使用GeneArt Precision gRNA合成试剂盒合成并纯化包含靶序列的sgRNA 。
预混Cas9蛋白（1 µl）和体外转录的sgRNA（2-3 µg），总量为1.5-2.1 µl，并在室温下孵育预混溶液10分钟。
孵育后，将含有CRISPR RNP的溶液与10μlMMG溶液（MMG-RNP）轻轻混合。
按照步骤B进行米合子的PEG-Ca 2+ 转染，除了使用MMG-RNP代替MMG-DNA。
如步骤C中所述培养转染的受精卵。

通过基因组DNA PCR和靶位点测序验证从PEG-Ca 2+转染的受精子再生的植物中的定向诱变
从预先用CRISPR-Cas9质粒或RNP转染的PEG-Ca 2+的受精卵再生的水稻植株的叶子切成小块（2-3 mm 2 ）。
根据制造商的说明，使用PrepMan Ultra 从切叶中制备基因组DNA 。
注意：在我们的研究中，将切好的植物叶片放入PrepMan Ultra 的40溶液中，并在95 °C下加热20分钟。之后，将加热的样品用100μl无菌水稀释，以用于后续的基因组DNA PCR。

使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，基因组DNA和每个靶标的引物组，扩增包含靶标位点的PCR片段。
基因组DNA PCR后，使用ExoSAP -IT Express PCR 纯化试剂纯化扩增的PCR片段，并确定PCR片段的核苷酸序列。
通过GENETYX软件中的Parallel Editor程序确认基因组编辑植物的定向诱变。还应使用SnapGene Viewer 确认基因组DNA上基因靶位点的Sanger测序色谱图。
当测序结果表明异源靶突变，在步骤F3中的扩增的PCR片段亚克隆到的pCR 使用Zero钝PCR克隆试剂盒，和质粒插入的从四个或转化的多个独立克隆的序列-Blunt矢量E. 大肠杆菌被确定。
如步骤F5 所述，确认基因组编辑植物的定向诱变。
注意：图5显示了当前基因组编辑程序的流程图。

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图5. 通过在受精卵中直接递送CRISPR-Cas9载体或RNP在水稻中进行基因组编辑的程序流程图。上部显示每个过程的持续时间（天）。粉色，绿色和橙色圆圈分别表示卵，精子和合子核。黄色的闪电和绿色的叶子形状分别指示电融合点和植物叶子的点。

菜谱

MMG解决方案
4 mM MES-KOH（pH 5.7）

15毫米MgCl 2

在甘露醇溶液中（对于米卵细胞，为370 mol / kg H 2 O；对于受精卵为450 mol / kg H 2 O）

PEG-Ca 2+ 溶液
30％聚乙二醇4000

100毫米CaCl 2

在甘露醇溶液中（对于米卵细胞，为370 mol / kg H 2 O；对于受精卵为450 mol / kg H 2 O）

已确认发言：

该协议改编自Uchiumi 等人。（2007），冈本（2011），户田（Toda）等人。（2016年和2019年），Koiso 等。（2017），户田和冈本（2020）。这项工作得到了JSPS（JSPS研究员的助学金；授予ET的编号19J12912），MEXT KAKENHI（创新领域科学研究的助学金）的部分资助。 17H05845和19H04868（TO）。

利益争夺

ET和TO是涉及本文所述协议的专利申请的共同发明人。

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