材料与试剂

1.  聚碳酸酯滤膜 (孔径0.22 µm、直径47 mm，Millipore, TSTP04700/ GTTP04700)
2.  DNA提取试剂盒 (MP Biomedicals, FastDNA Spin Kit)
3.  高保真PCR酶试剂 (New England Biolabs, Phusion High-Fidelity PCR Master Mix)
4.  18S rRNA基因通用引物，例如：1) V9可变区引物 1380F (5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′) 和引物1510R (5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′)；2) V4可变区引547F (5′-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3′) 和引物967R (5′-ACTTTCGTTCTTGAT-3′) 或 引物Ek-NSF573F (5′-CGCGGTAATTCCAGCTCCA-3′) 和引物Ek-NSR951R (5′-TTGGYRAATGCTTTCGC-3′)
5.  96孔板和封板膜 (Roche, LightCycler 480 Multiwell Plate 96)
6.  上样缓冲液Loading buffer (Takara, 6×Loading Buffer, Cat. No. 9156)
7.  琼脂糖粉末 (Sigma, A9539-250G)
8.  Tris-乙酸盐-EDTA缓冲液 (Solarbio, 50×TAE)
9.  DNA标记 (DNA Marker) (New England Biolabs, 50bp DNA Ladder, NEB #B7025)
10.  凝胶纯化试剂盒 (南京诺唯赞, DC301-01)
11.  Qubit分子定量试剂盒 (Promega, QuantiFlour dsDNA System)
    
    

仪器设备

1. 200 µm尼龙筛绢 (绍兴华丰, 80目)
2.  不锈钢过滤装置及配套玻璃滤杯、滤芯 (天津津腾, JTFA0214)
3. 真空泵 (上海亚荣, SHZ-III)
4. 高压灭菌锅 (TOMY, Sx-500)
5.  5 L量杯
6.  500 ml量筒
7.  超低温冰箱 (Thermo, ULT1386-5v)
8. 移液器 (Eppendorf, 100–1000 μl, 10–100 μl 20–200 μl, 2–20 μl, 0.5–10 μl, 0.1–2.5 μl)
9.  超净工作台 (苏净安泰, Airtech)
10. 均质仪 (杭州奥盛, Bioprep-24)
11. 离心机 (Eppendorf, 5417R)
12.  超微量紫外分光光度计 (NanoDrop ND-1000)
13.  干式加热器 (Labnet, D1100-230V)
14.  旋涡混合器 (海门其林贝尔, Vortex-6)
15.  200 μl八联移液器 (Brand, 10-200 μl)
16. 96孔板离心机 (杭州奥盛, Mini-P25)
17.  PCR热循环仪 (Bio-Rad, S1000)
18.  电泳仪 (北京六一, DYY6C)
19. 电泳槽 (北京六一, JYCP31DN)
20. 凝胶成像仪 (上海培清, JS-680B)
21.  核酸测定仪 (ThermoFisher, Qubit 4.0)
22.  其他 (聚乙烯塑料桶、铝箔纸、移液器吸头、离心管、剪刀、镊子、酒精灯、烧杯)
    

实验步骤