研究背景

血栓事件发生率在全球逐年增加。其中，动脉血栓形成是缺血性心脏病与中风的关键病理机制，而静脉血栓形成可导致静脉栓塞与肺栓塞，是癌症病患中的主要致死因素。抗血栓治疗主要包括抗凝与抗血小板治疗。前者代表性药物如肝素、华法林等，主要通过抑制凝血级联反应中的凝血因子发挥作用；后者则主要作用于血小板活化信号通路中的关键靶点，如环氧化酶抑制剂阿司匹林通过抑制血栓素A2合成发挥抗栓作用，是心脑血管血栓性事件二级预防的一线用药（Depta and Bhatt, 2015）。然而，包括阿司匹林在内的抗栓药物仍存在较多临床局限性，如导致消化道出血等，临床使用仍存在争议(Raber et al., 2019)。因此，抗栓治疗领域的新药研发仍是重要研究方向。在血栓性疾病的病理机制研究和新药研发中，对实验模型的血流动态分析极为必要。斑马鱼是新兴脊椎动物模式生物，因其繁殖力强，胚胎体型小且早期透明等独特优势，倍受发育生物学及大规模毒理学及药理学筛选相关研究的青睐。其中，斑马鱼胚胎在受精后24小时即建立全身血液循环，且其心血管系统相关信号通路与人类高度保守，故成为研究心血管循环相关疾病的理想动物模型。本课题组前期工作结合红细胞特异性荧光标记转基因荧光鱼，例如Tg (LCR:eGFP) 鱼系 (Ganis et al., 2012)，Tg (gata1:eGFP) 鱼系 (Traver et al., 2003)等，使用苯肼构建血管内皮及红细胞膜损伤相关的血栓疾病模型，对活血化瘀类中成药中的抗栓活性成分进行了筛选及深入分析(Sheng et al., 2020；Li et al., 2021)。实验工作中发现，使用手动式显微镜逐孔视频拍摄，及后期基于视频与其他图像处理软件的红细胞流速定量分析过程对时间与人力成本要求较高，难以适应大规模药理筛选的通量要求。而使用高内涵成像系统，可自动进行拍摄，并通过其配套软件完成血流定量分析，具有操作简便、通量大、及活体动态观测等优势，可应用于抗血栓药物及相关药物的大规模高通量体内筛选。因此本文以苯肼血栓疾病造模为例，介绍高内涵成像在斑马鱼活体胚胎进行血流动态分析相关实验方法，对该方法在观测血栓性疾病的应用进行了展示。

材料与试剂

1. Tg (LCR:eGFP) 转基因斑马鱼 (Ganis et al., 2012) (购自浙江大学公共技术平台斑马鱼分平台)
2. 苯肼 (阿拉丁, catalog number: G1324044)
3. 阿司匹林 (碧云天, catalog number: M0119A)
4. 1-苯基-2-硫脲(PTU) (Sigma-Aldrich, catalog number: 103-85-5)
5. 亚甲基蓝 (阿拉丁, catalog number: M19650)
6. 3-氨基苯甲酸乙酯 (Sigma-Aldrich, catalog number: MS-222)
7. 二甲基亚砜 (阿拉丁, catalog number: D103281)
8. 蛋白酶 (Roche, catalog number: 165921)
9. 一次性实验室用塑料吸管 (为尔康, catalog number: W208)
10. 96孔黑板 (Corning, catalog number: 3340)
11. E3胚胎培养液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 高内涵成像系统 (Molecular Devices, model: ImageXpress Micro Confocal)
2. 体式显微镜 (麦克奥迪, model: SMZ-168)
3. 微量移液器 (德国, model: Eppendorf)
4. 实验用斑马鱼养殖与繁育系统 (上海海圣, model: Z-C-D5)
5. 智能生化培养箱 (宁波赛福, model: SPX-250)
   

实验步骤