材料与试剂

1. 15 ml离心管 (Falcon, catalog number: 352097)
2. 5 ml流式管 (Falcon, catalog number: 352008)
3. 200目细胞过滤膜
4. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, catalog number: B2261)
5. NaCl
6. Na₂HPO₄
7. KCl
8. KH₂PO₄
9. 70%乙醇
10. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
11. 核糖核酸酶 (Roche, catalog number: 11119915001)
12. 磷酸缓冲液 (1× PBS) (见溶液配方)
13. 碘化丙啶 (PI) 溶液 (见溶液配方)
14. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液 (见溶液配方)
15. Hoechst 33342溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 涡旋混合器 (其林贝尔, model: VORTEX-6)
2. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)
3. 光学显微镜 (Olympus, model: IX73)
4. 流式细胞仪 (BD FACSFortessa)
   

实验步骤

1. 固定细胞PI染色法 (Davies和Allen, 2007)
   
   1.1

   收集2 × 10⁵细胞，200 × g离心2分钟，去除上清，并用1 ml 1× PBS (不含Ca²⁺、Mg²⁺) 清洗一次。
   1.2

   用0.5 ml预冷的70%乙醇重悬固定细胞，在涡旋器上一滴一滴地加入乙醇，4 °C固定30分钟以上。在醇类固定剂中-20 °C下可以存放几个星期。
   1.3

   200 × g离心2分钟，去除乙醇，并用1 ml 1× PBS清洗三次。
   1.4

   用含50 μg/ml PI和200 μg/ml RNase的0.5 ml 1× PBS重悬细胞，37 °C孵育30分钟。
   1.5

   无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管。
   1.6

   上机检测，用561 nm的激光激发PI，收集610/20 nm波段的发射光，低速上样，总共记录20,000个目的细胞。
2. 活细胞Hoechst 33342染色法
   
   2.1

   收集2 × 10⁵细胞，200 × g离心2分钟，去除上清，用1 ml 1× PBS (不含Ca²⁺、Mg²⁺) 清洗一次。
   2.2

   用含10 μg/ml Hoechst 33342的PBS重悬细胞，37 °C孵育30分钟。
   注：Hoechst 最佳浓度和染色时间需要根据具体的每种细胞来确定，一般浓度在5~20 μg/ml，孵育时间为30~120分钟。
   
   2.3

   无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管，放置冰上。
   2.4

   上机检测，用355 nm的激光激发Hoechst 33342，收集450/50 nm波段的发射光，低速上样，总共记录20,000个目的细胞。

注意事项

1. 一定要做细胞计数，确保细胞数与固定剂量和染料的浓度相匹配。一般来说细胞浓度控制在2 × 10⁵~2 × 10⁶细胞/毫升。
2. 贴壁细胞的消化时间要控制好，消化时间过长，细胞易成团。可边消化边观察。
3. 如果细胞标记荧光蛋白或需要做表面标记，不能使用醇类固定剂，可以使用醛类固定剂。使用醛类固定剂时可以加0.1% Triton X-100。
4. 醇类固定后的样品可以在-20 °C存放几个星期，若短时间可置于4 °C避光保存。
5. 上样速度不宜过快，细胞浓度不宜过高，一般低流速、200个细胞/秒为佳。
   

结果与分析

细胞周期的分析，以HeLa细胞为例，图1为固定细胞PI染色法，图2为活细胞Hoechst 33342染色法。首先用前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出细胞群，再用荧光通道的W (宽度)/A (面积)去除粘连细胞，最后用荧光通道的柱状图分析细胞周期。图中所标a、b和c分别代表G0/G1期细胞、S期细胞和G2/M期细胞。


图1. 固定细胞PI染色法检测细胞周期


图2. 活细胞Hoechst 33342染色法检测细胞周期

失败经验

染料浓度过高或过低或染色时间不够，都可能导致DNA的四倍体峰无法显示。

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1× PBS)
   NaCl           8 g
   Na₂HPO₄  2.9 g
   KCl             0.2 g
   KH₂PO₄    0.2 g
   溶于1 L ddH₂O中
   调整pH值为7.2~7.4，过滤灭菌，4 °C保存
2. 碘化丙啶 (PI) 溶液
   2.5 mg PI溶于1 ml ddH₂O中，4 °C保存
   
3. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液
   0.5 mg核糖核酸酶溶于0.5 ml 10 mM的Tris-HCl (PH 7.5) 中
   100 °C加热15分钟
   缓缓冷却至室温后分装成小份保存于-20 °C
4. Hoechst 33342溶液
   10 mg Hoechst 33342溶于1 ml ddH₂O中，4 °C保存
   

致谢

感谢中科院生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台的全体成员的建议和帮助。

参考文献

1. Cooper, G. M. (2000). Chapter 14: The Eukaryotic Cell Cycle. In: The cell: a molecular approach. 2nd edition. Washington, D.C: ASM Press. ISBN: 978-0-87893-106-4.
2. Davies, D. and  Allen, P.  (2007). Chapter 7: DNA Analysis by Flow Cytometry. In: Flow Cytometry. Principles and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press. ISBN: 978-1-58829-691-7.