In vitro differentiation of mESCs in embryoid bodies

Materials:

• mESC medium:  

  Reagent	Manufacturer Id	Volume
  DMEM	Gibco 21969035	500 ml
  Pansera ES	PAN Biotech P30-2602	90 ml
  L-Glutamine	Gibco 25030024	6 ml
  Pen/Strep	Gibco 15140122	6 ml
  Non-essential-amino-acids	Gibco 11140035	6 ml
  Sodium Pyruvate	Gibco 11360039	6 ml
  ß-mercaptoethanol	Sigma M3148	4.2 µl
  LIF (107 units/ml)	ESGRO ESG1106	60 µl

   

• Cellular aggregation (CA) medium:   

  Reagent	Manufacturer Id	Volume
  DMEM	Gibco 21969035	500 ml
  Pansera ES	PAN Biotech P30-2602	58 ml
  L-Glutamine	Gibco 25030024	5.8 ml
  Pen/Strep	Gibco 15140122	5.8 ml
  Non-essential-amino-acids	Gibco 11140035	5.8 ml
  ß-mercaptoethanol	Sigma M3148	5.8 µl

   

• Trypsin‐EDTA (0.25%, Gibco 25200056)  
• Retinoic Acid (Sigma R2625), 5mM in DMSO, light‐sensitive, store at ‐80°C  
• Non‐adherent petri dishes (Greiner 633102)

Protocol:  

• Trypsinize mESCs, quench with mESC medium, spin down, remove mESC medium  completely and resuspend cells in CA medium 
• Measure cell density  
• Plate 3.5x106 cells per 10 cm dish in 15 ml CA medium on non‐adherent petri dish 
• Take rest pellet for undifferentiated mESC control
• Grow in 5% CO2 cell culture incubator (atmospheric O2) 
• Change medium after 2 days, 4 days and 6 days:  
  • Collect embryoid bodies (EBs) with 25ml pipette in 50ml falcons, gently  
  • Let EBs settle by gravity (a few minutes)  
  • Aspirate supernatant, don’t disturb the EBs  
  • Resuspend the EBs in 15ml fresh CA medium, gently  
  • Plate the EBs back on a new non‐adherent dish, gently 
• For treatment with retinoic acid, start on day 4 of differentiation (half of each plate):  
  • Thaw an RA aliquot  
  • Resuspend EBs in 15ml CA medium + 15µl RA (1:1000, 5µM final) instead of CA medium only. RA is light sensitive. Work without light.  
  • (Do the same on day6)