Practical Methods for Arbuscular Mycorrhizal Fungal Spore Density, Hyphal Density and Colonization Rate of AMF

研究背景

丛枝菌根是球囊菌门真菌与植物根系组成的共生体系，是一类重要的内生菌根类型(Brundrett and Tedersoo, 2018)。丛枝菌根真菌(AMF)能够与陆地生态系统中大多数植物形成共生关系，帮助植物吸收N、P等矿质元素，提高植物生产力与抗逆性，此外还具有促进土壤水稳性团聚体的形成，改善土壤环境等生态学意义(Smith and Read, 2008)。AMF侵染植物后会在植物根皮层组织内形成典型的无隔膜的丛枝(arbuscule)、根内菌丝(intraradical hyphae)和泡囊(vesicle)结构，根外结构则包括土壤中的孢子(spore)和根外菌丝(extraradical hyphae) (Smith and Read, 2008)。其中，丛枝是AMF侵入植物根系皮层细胞后连续双叉分枝形成的类似树枝状的菌丝结构，是真菌与植物进行物质交换的重要场所，丛枝的卷曲结构增加了其物质交换的表面积，因此丛枝的侵染率常被用于评价AMF-宿主植物的共生状态。泡囊是根内菌丝末端膨大而成，富含脂类物质和碳水化合物等，约有80%的AMF可形成泡囊结构，其被认为是养分储存结构和繁殖器官。根内菌丝则负责传输营养物质，与植物和真菌的营养交换有关(Johnson et al., 2003)。根外菌丝在土壤中形成庞大的菌丝网络，主要是用于扩展AMF在土壤中的侵染空间以及吸收土壤中的矿质营养和水分(Miller, 1995)，此外，还参与土壤团聚体的构成，可提高团聚体的稳定性，改善土壤状况(Rillig, 2004)。孢子是AMF发育到一定阶段在根外菌丝上形成的厚壁无性繁殖器官，也是一些脂类的储藏结构(Smith and Read, 2008)。传统的AMF鉴定方法主要以孢子的形态特征为依据，许多科研工作者在这方面开展了大量研究并对AMF不同种属的孢子特征作了详细的描述，以网站的形式提供给研究人员参考 (http://invam.wvu.edu/) (Stürmer et al., 2021)，极大地方便了AMF的鉴定。然而孢子的产生受环境与宿主的影响，因此土壤中孢子的群落与植物根系中 AMF定殖情况有所差异，孢子计数往往不能真实反映植物根内AMF的群落结构和丰度的变化(Clapp et al., 1995)。随着分子生物技术手段的不断发展，高通量测序技术被广泛用于检测土壤或宿主根内的群落结构和多样性，但只能得到分子种，无法获得AMF菌株资源(刘永俊和冯虎元, 2010) ，且无法对其进行定量分析。而对AMF侵染效果(侵染率)和生物量(孢子密度、菌丝密度)的测定，不仅是菌根学研究中一项重要的基础性工作，同时也能够在一定程度上解决对AMF的定量问题。
本实验中，AMF侵染率测定基于染色镜检法，主要分为根系透明-染色-分色3个过程。关于染色方法目前国内外比较常用的有台盼蓝染色法和酸性品红染色法，而关于侵染率的统计方法主要有十字交叉法、根段侵染率加权法等。由于研究者所采用的方法不同，其结果也会存在差异。关于侵染率不同测定方法的比较可参考盛萍萍等(2011)人的文章。本文重点介绍采用台盼蓝染色和十字交叉法计算AMF侵染率。关于土壤中菌丝密度的测定同样也是基于台盼蓝染色和网格交叉法的原理，土壤中孢子的分离则是基于蔗糖密度梯度离心法的原理，采用湿筛倾析-蔗糖梯度离心法进行测定(Brundrett et al., 1994)。

材料与试剂

1. 组织包埋盒
2. 载玻片
3. 盖玻片
4. 移液枪头 (5 ml) 
5. 0.45 μm微孔滤膜
6. 100 ml离心管
7. 培养皿
8. 根际风干土壤
9. 新鲜根系
10. 10% KOH溶液
11. 蒸馏水
12. 自来水
13. 2% HCl溶液
14. 0.05% 台盼蓝 (乳酸:甘油:蒸馏水 = 1:1:1) 
15. 脱色液 (甘油:乳酸:蒸馏水 = 1:1:1) 
16. 45%-50%蔗糖溶液
    

仪器设备

1. 剪刀
2. 千分之一天平
3. 500 ml烧杯
4. 水浴锅
5. 镊子
6. 计数器
7. 光学显微镜
8. 高速粉碎机
9. 磁力搅拌机
10. 20目筛
11. 400目筛
12. 移液枪 (5 ml) 
13. 过滤器
14. 真空抽滤泵
15. 玻璃棒
16. 离心机（有效半径2.5 cm）
17. 体视镜
    

实验步骤

图1. 丛枝菌根真菌 (AMF) 孢子、菌丝密度和侵染率测定实验流程

一、孢子密度测定 (Spore Density)

1. 称取10-20 g风干土样放入烧杯内，用100 ml自来水浸泡20-30 min。
2. 待大的石砾或者杂物沉积在烧杯底部，将上悬液迅速倒在上下分别为20目和400目的双层筛中。
3. 用洗瓶将下层筛中的过滤物冲洗至100 ml离心管中，3000 rpm离心3 min。
4. 除去水面杂物及上清液。有时上清液中含有较轻的孢子，应先检查后再除去。
5. 向沉淀物中加入45%-50%的蔗糖溶液至离心管的2/3。
6. 搅拌均匀后迅速放入离心机，3000 rpm离心2 min。
7. 将上悬液迅速过400目筛，并用自来水冲洗数分钟以除去残留的蔗糖溶液。
8. 用洗瓶依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛余物，将其轻轻冲洗到一个清洁的培养皿中。
9. 转移至培养皿后，于体视镜下进行观察统计培养皿内所有孢子数量。
   
   
   

1. 称取5 g过1 mm筛的风干土样至高速粉碎机中，加入50 ml自来水，充分搅拌30 s (10,000 rpm)。 
2. 将上清液倒入上下分别为20目和400目的双层筛中，并用200 ml自来水将400目上的筛余物转移到500 ml烧怀中。
3. 将烧杯放置于磁力搅拌器进行搅拌，1000 rpm离心30 s。 
4. 静置30 s。
5. 利用移液枪在液面下1 cm处吸取5 ml，通过真空抽滤泵过0.45 μm孔径的微孔滤膜。
6. 将过滤后的滤膜置于载玻片。
7. 重复3至6步，每个样品制备3个滤膜。
8. 在滤膜上滴加3滴0.05%的台盼蓝。
9. 待风干后加1滴乳酸甘油，盖上盖玻片。
10. 在200×带网格测微网的显微镜下观察25个视野。 
11. 使用网格交叉法计数交叉点，计数方法如图2。其中AMF菌丝与非AMF菌丝主要通过菌丝的形态及着色进行区分，AMF菌丝无隔、多分枝且被台盼蓝染成蓝色。
    
    
    图2. 丛枝菌根真菌 (AMF)菌丝密度网格交叉法
    
    
12. 将菌丝长度换算为菌丝密度 (m g^-1 soil)。
    菌丝密度公式(Brundrett, 1994)：
    
    注释：
    11/14是网格计算方法中的一个常数，25为视野个数。
    稀释倍数：每次从200 ml转移液中吸取5 ml过滤膜，因此稀释倍数为40倍。
    网格单元格长度：一般实验室显微镜最小单元格的边长设置为1 mm
    网格面积：正方形网格边长为1 cm，面积为 1 cm²
    滤膜面积：油水混合膜（膜的规格可咨询经销商）

1. 称取1-2 g左右的新鲜根系，清洗后剪成约1 cm的根段，放入组织包埋盒内。
2. 将组织包埋盒放入装有10% KOH溶液的500 ml烧杯中浸没，90 °C水浴锅内放置10 -90 min(不同根系样品水浴时间不同，目的是去除根系细胞内含物和细胞壁色素，使得根系透明)。
3. 弃去KOH溶液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。
4. 将组织包埋盒浸泡在装有2% HCl溶液的烧杯内，常温5-10 min
5. 弃去HCl溶液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。
6. 将组织包埋盒浸泡在装有0.05%台盼蓝溶液的烧杯内，90 °C水浴锅内染色10-30 min。
7. 弃去染液，用镊子夹住组织包埋盒，蒸馏水冲洗干净。
8. 将组织包埋盒浸泡在装有脱色液的烧杯内，常温脱色2-3 d。
9. 脱色后随机挑取30-50个根段制片，每张载玻片压制10根。
10. 在200×显微镜下采用如图3所示的十字交叉法进行侵染率测定(McGonigle et al., 1990)，显微镜十字线中的一条与根系平行，观察另一条与菌丝、丛枝、泡囊是否存在交叉点，每个根段观察10个视野，共计100个视野。
    
    
    图3. AMF侵染率十字交叉法(仿McGonigle et al., 1990)
    
    
11. 采用0-1计数，将有菌丝、丛枝和囊泡交叉的分别记为1，没有则记为0，统计结果记录在表1。之后根据如下公式进行计算：
    泡囊侵染率=（泡囊侵染交叉点数÷总交叉点数）×100%
    总侵染率=[(总交叉点数-无侵染交叉点数)÷总交叉点数]×100%
    注：菌丝与丛枝侵染率的计算方法与泡囊相同
    例如表1中，样品1的泡囊侵染率 = (38÷355) ×100% = 10.70%
    丛枝侵染率 = (23÷355) ×100% = 6.48%
    菌丝侵染率 = (134÷355) ×100% = 37.75%
    总侵染率 = [(355-160)÷355]×100% = 54.93%
    
    表1 丛枝菌根真菌 (AMF)侵染率统计
    

    组别	玻片数	交叉数
    		无侵染	泡囊	丛枝	菌丝	合计
    样品1	1	50	15	9	48	122
    	2	54	13	8	46	121
    	3	56	10	6	40	112
    合计		160	38	23	134	355

溶液配方

1. 10% KOH溶液
   天平称取10 g KOH，向烧杯内加入90 g (90 ml) 蒸馏水并用玻璃棒搅拌至完全溶解。 
2. 0.05%台盼蓝 (乳酸:甘油:蒸馏水 = 1:1:1)
   天平称取0.15 g台盼蓝，放入烧杯后加入100 ml蒸馏水、100 ml乳酸、100 ml甘油，并用玻璃棒搅拌至完全溶解。配制完成后置于4 °C冰箱中保存备用。
3. 脱色液
   在烧杯中加入100 ml蒸馏水、100 ml乳酸、100 ml甘油，并用玻璃棒搅拌至完全溶解。配制完成后置于4 °C冰箱中保存备用。
4. 45%-50%蔗糖溶液
   天平称取45-50 g蔗糖，放入烧杯后加入50-55 g (50-55 ml) 自来水并用玻璃棒搅拌至完全溶解。
   

致谢

感谢北京林业大学大学生创新创业训练计划(X202110022240)及北京林业大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(BLX201937)对本研究的大力支持，感谢中国农业大学张林副教授对实验流程提供的指导。

附图1

附图1. 丛枝菌根真菌（AMF）显微镜观察照片 a.显微镜下的AMF孢子；b.土壤中AMF菌丝结构；c.根系中AMF侵染结构。

参考文献

1. 刘永俊, 冯虎元. (2010). 丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展. 应用生态学报, 216: 1573-1580.
2. 盛萍萍, 刘润进, 李敏. (2011). 丛枝菌根观察与侵染率测定方法的比较. 菌物学报, 30(4): 519-525.
3. Smith, S. E. and Read, D. J. (2008). Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, Cambridge, UK.
4. Brundrett, M.C. and Tedersoo, L. (2018). Evolutionary history of mycorrhizal symbioses and global host plant diversity. New Phytol 220:1108-1115.
5. Johnson, N. C., Rowland, D. L., Corkidi, L., Egerton-Warburton L. M. and Allen E. B. (2003). Nitrogen enrichment alters mycorrhizal allocation at five mesic to semiarid grasslands. Ecology 847: 1895-1908.
6. Miller, R. M., Reinhardt, D. R. and Jastrow, J. D. (1995). External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrassprairie communities. Oecologia 103: 17-23.
7. Rillig, M. C. (2004). Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol Lett 7: 740-754.
8. Stürmer, S. L., Bever, J. D., Schultz, P. A. and Bentivenga, S. P. (2021). Celebrating INVAM: 35 years of the largest living culture collection of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza 31:117-126
9. McGonigle, T. P., Miller ,M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L. and Swan, J. A. (1990). A new method which gives an objective measure of colonization of roots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol 1153: 495-501.
10. Brundrett, M. M. L. and Peterson, L. (1994). Practical methods in mycorrhiza research. Mycologue Publication, University of Guelph, Canada.
11. Clapp J. P., Young J. P. W., Merryweather J. W. and Fitter A. H.. (1995). Diversity of Fungal Symbionts in Arbuscular Mycorrhizas from a Natural Community. New Phytol 130(2): 259-265.