Detection of Surface Adhesion Ability of Lactic Acid Bacteria

材料与试剂

1. 离心管 (1.5 ml, 5 ml)
   
2. 记号笔
   
3. 胰蛋白胨 (生工，catalog number: A505250)
   
4. 酵母粉 (生工，catalog number: A515245 酵母提取物)
   
5. 氯化钠 (上海沪试)
   
6. 琼脂 (生工，catalog number: A505255)
   
7. LB肉汤培养基 (生工，catalog number: A507002)
   
8. MRS肉汤培养基 (赛默飞，catalog number: CM1175)
   
9. 十二烷 (国药，catalog number: TD096801)
   
10. 二甲苯 (国药，catalog number: 10023418)
    
11. 氯仿 (国药，catalog number: 10006818)
    
12. PBS缓冲液 (国药，catalog number: HYSH3025601)
    
13. LB固体培养基 (见溶液配方)
    
14. MRS固体培养基 (见溶液配方)
    
15. LB液体培养基 (见溶液配方)
    
16. MRS液体培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 量筒
   
2. 玻璃棒
   
3. 离心机 (艾本德5424)
   
4. 紫外分光光度计 (北京普析)
   
5. 90 mm塑料培养皿 (biosharp, BS-90-D)
   
6. 纯水制备仪 (ELGA PURELAB系列)
   
7. 移液枪
   
8. 吸头 (生工，F601227)
   
9. 烘箱 (天津泰斯特101-0AB型电热鼓风干燥箱)
   
10. 厌氧培养箱 (Whitley，DG250)
    
11. 超净工作台 (天津泰斯特，CJ-2D)
    
12. 10 μl接种环 (生工，F619312)
    
13. 高压灭菌锅 (上海庆开，GI54TW)
    
14. 冰箱 (美菱)
    
15. 摇床 (Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪)
    

软件

1. Excel

实验步骤

1. 制备一定浓度的乳酸菌悬液
   
   1.1

   菌的复苏
   将菌保从-80 °C冰箱取出置于冰上，用接种环以平板划线的方式将菌种接种到MRS固体培养基平板，37 °C恒温箱倒置培养过夜。
   注：菌保拿出后要及时放回去，以免损失菌的活性。
   1.2

   接种
   用灭菌的枪头或牙签挑取平板上由单个菌生长成的单菌落，置于装有1 ml MRS培养液的1.5 ml或者2.0 ml的微型离心管里，混匀并标记。将离心管置于37 °C，摇床培养18 h。
   1.3

   菌种活化
   取100 μl培养18 h的菌液转移至另一个含900 μl MRS培养液的微型离心管中继续培养18 h，重复此操作两次。目的是提高乳酸菌活性。
   1.4

   扩大培养
   将在微型离心管中培养的菌液转入装有50 ml MRS培养液的灭菌小锥形瓶中，37 °C培养箱培养18 h。
   注：以上过程都要在超净工作台上进行，需要严格无菌操作。
   1.5

   离心
   将培养了18 h的乳酸菌菌液以3,000 × g的速度离心10 min，弃去上清液。
   1.6

   洗涤
   加入等量灭菌后的PBS缓冲液，重悬混匀，以3,000 × g的速度离心10 min，重复此步骤2-3次。加入少量PBS缓冲液并重悬混匀。
   1.7

   调节浓度
   以一定比例将乳酸菌菌液与PBS缓冲液混合，使混合溶液在600 nm的波长下OD值在0.8左右，记为A₀。
2. 测定细胞疏水性
   2.1

   将1 ml的疏水剂 (十二烷、二甲苯或氯仿等) 分别加入到3 ml的乳酸菌悬液中，充分混匀。每种疏水剂至少设立三个平行组。
   2.2

   室温下静置20 min，使有机相和水相分离。
   2.3

   去除有机相，以PBS缓冲液为对照在600 nm下测定水相的OD值，记为A_t。
   2.4

   重复实验至少三次并计算。Hydrophobicity (%) = [ (A₀－A_t) / A₀ ] × 100%； (疏水性分为低：0~29%、中：30%~59%和高：60~100%) (Niederle. et al., 2019)
3. 测定细胞自凝集能力集能力
   取4 ml调节浓度后的乳酸菌悬液充分混匀，室温孵育5 h。吸取1 ml菌悬液，以PBS缓冲液作为对照在600 nm下测定OD值，记为A_t。
   实验重复三次并计算：Auto-aggregation (%) =1-A_t /A₀×100% (Del Re et al., 2000)
   注：孵育5 h后取菌悬液时，取表面菌液，禁止吹打，保持菌液静止。
4. 测定细胞共凝
   4.1

   制备病原菌的菌悬液
   1) 将病原菌 (如S. aureus ATCC 25923, S. typhimurium ATCC 14028，和L. monocytogenes ATCC 19113) 在LB液体培养基中37 °C培养18 h。
   2) 离心
       将培养了18 h的菌液以3,000 × g的速度离心10 min，弃去上清液。
   3) 洗涤
       加入等量灭菌后的PBS缓冲液，重悬混匀，3,000 × g离心10 min，重复此步骤2-3次。加入少量PBS缓冲液并重悬混匀。
   4) 调节浓度
       以一定比例将菌液与PBS缓冲液混合，使混合溶液在600 nm的波长下OD值在0.8左右，记为A₀。
   4.2

   将各乳酸菌悬浮液和致病菌悬浮液等体积 (2 ml) 混合，在室温下静置孵育5 h。在相同生长条件下培养含4 ml单菌悬液的对照组，在600 nm下测定OD值。实验重复三次并计算：Co-aggregation (%) = [ (A_x+A_y) /2 - A _(x+y) ] / (A_x+A_y) × 100%。(A_x和A_y代表两个细菌悬液的吸光度，A _(x+y) 意味着混合细菌悬液的吸光度) (Xu et al., 2009)

结果与分析

1. 疏水
   
   表1. 4株乳酸菌疏水性质的检测 (Chen et al., 2020)
   
   注：数据为平均数±标准差 (n = 3) ，同一行内不同上标字母的均值差异有统计学意义 (p < 0.05)。
   
   细胞疏水性是益生菌粘附肠道上皮细胞，定植胃肠道发挥益生菌有益作用的前提。疏水性分析表明，四株菌株均具有高疏水性(表1) 。HSM-1，HSM-10和HSM-14 在十二烷和二甲苯的疏水性高于在氯仿中，但在氯仿中HSM-18的疏水性 (97.1 ± 0.7%) 高于十二烷 (86.8 ± 3.8%) 和二甲苯 (84.8 ± 1.9%) 。因此，实验表明四株菌株均具有高疏水性，其中HSM-10具有最高的疏水性。
   
2. 自凝集和与病原菌的共凝集
   
   表2. 4株乳酸菌自凝集与共凝集性质的检测 (Chen et al., 2020)
   
   注：数据为平均数±标准差 (n = 3) ，同一行内不同上标字母的均值差异有统计学意义 (p < 0.05)。
   
   潜在的益生菌应具有在肠道定植和阻止致病菌的定植的能力。细胞的自聚集能力对肠细胞的粘附和避免病原体的定植做出了重要贡献。而细菌的共聚集能力通过阻止它们粘附宿主组织来消除胃肠道病原体。
           在4株检测的乳酸菌菌株中，HSM-1和HSM-10的自凝集能力最好，分别为59.9 ± 4.9%和63.5 ± 13.1% (表2)。相对而言HSM-14和HSM-18的自凝集能力较低 (分别为16.5 ± 4.1%和23.7 ± 2.3%)。
           四株菌株对金黄色葡萄球菌均表现出较高的共凝集能力 (分别为52.0 ± 14.9%，35.7 ± 2.3%，51.1 ± 13.1%，52.1 ± 2.9%)。HSM-10和HSM-14对李斯特菌具有高共凝集能力，其次是HSM-1和HSM-18。而对于沙门氏菌，只有HSM-14表现出高的共凝集能力。
           HSM-1、HSM-10、HSM-18与金黄色葡萄球菌的共聚集均超过50%，效果优于鼠伤寒和单核增生L.

溶液配方

1. LB固体培养基        1,000 ml
   LB培养基粉末        25 g
   琼脂粉                    12.5 g
   
2. MRS固体培养基    1,000 ml
   MRS培养基粉末    52 g
   琼脂粉                   14.4 g
   
3. LB液体培养基       1,000 ml
   LB培养基粉末       25 g
   
4. MRS液体培养基   1,000 ml
   MRS培养基粉末   52 g
   

注：MRS培养基灭菌温度为115 °C、20 min，LB培养基、锥形瓶等灭菌温度为120 °C、20 min。

致谢

感谢国家自然科学基金青年项目 (31700004)，全国大学生平台创新和创业培训项目(S202010542046)，湖南省科技厅创新人才与平台计划 (2019RS5001)，湖南创新型省份建设专项经费 (2019RS3022) 的支持。

参考文献

1. Chen, T., Wang, L., Li, Q., Long, Y., Lin, Y., Yin, J., Zeng, Y., Huang, L., Yao, T., Abbasi, M. N., Yang, H., Wang, Q., Tang, C., Khan, T. A., Liu, Q., Yin, J., Tu, Q. and Yin, Y. (2020). Functional probiotics of lactic acid bacteria from Hu sheep milk. BMC Microbiol 20(1): 228.
2. Del Re, B., Sgorbati, B., Miglioli, M. and Palenzona, D. (2000). Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Lett Appl Microbiol 31(6): 438–442.
3. Niederle, M. V., Bosch, J., Ale, C. E., Nader-Macías, M. E., Aristimuño Ficoseco, C., Toledo, L. F., Valenzuela-Sánchez, A., Soto-Azat, C. and Pasteris, S. E. (2019). Skin-associated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PloS one 14(9): e0223020.
4. Xu, H., Jeong, H. S., Lee, H. Y. and Ahn, J. (2009). Assessment of cell surface properties and adhesion potential of selected probiotic strains. Lett Appl Microbiol 49(4): 434–442.