Protocol for Sampling of Root and Rhizosphere Soils from Trees in Natural Fields

 
图1. 杨树地上地下部分共生菌类型 (图片引自潘雪玉，2018)

材料与试剂

1. 标签纸
2. 采样记录表
3. 冰袋或干冰
4. 无菌采样袋
5. 油性记号笔
6. 50 ml离心管
7. 一次性无菌乳胶手套
8. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 7647-14-5)
9. Na₂HPO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 20040618)
10. NaH₂PO₄ (国药集团化学试剂有限公司，沪试，catalog number: 20040818)
11. 10 mM PBS溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 铁铲
2. 取土钻
3. 修枝剪
4. GPS定位器 (南京君灿仪器设备有限公司，彩途，model: K82B)
5. 生物样品采样箱
6. 小锄头 (中间半椭圆豁口)
7. 全温振荡器 (苏州培英实验设备有限公司，培英，model: THZ-C-1)
8. 台式高速冷冻离心机 (Sigma公司，Sigma，model: 3K15)
   

实验步骤

一、采样计划与前期准备

1. 确定采样目的、区域、样点分布等。
2. 准备器具：详见材料与试剂，仪器设备。
3. 制定采样记录表，包括如下内容：采样点经纬度、采样日期、采样人、气候信息 (包括气温、降雨、湿度等)，以及所有影响后续研究的其他环境因素。
   
   

二、根系取样

1. 建议选择具有代表性的土壤，一般随机选择健康的树木作为根际土取样目标。采样时建议使用五点取样法采集样品，即先确定对角线的中点作为中心取样点，而后在对角线上选择与中心点距离相等的点进行取样。或者使用等距离取样法，由取样的比率决定距离或间隔 (图2)。
   
   
   图2. 五点取样法和等距取样法示意图
   
   
2. 采样使用的所有工具、采样袋或其他物品等，均需无菌。若野外缺乏合适的灭菌条件，可以使用采集位点临近区域的原始土壤对取样工具进行擦拭，尽量去除干扰。
3. 用铲子去除地表植被和其他杂质，使用小锄头轻轻刨开土壤，寻找树木的细根(直径≤2 mm) (Berhongaray et al., 2013)，或使用土钻获取土壤和根系的混合样，再挑出细根。细根是树木吸收养分和水分的主要器官 (Guo et al., 2008)，同时也是与土壤接触最为密切的器官 (Norby and Jackson, 2000)，对树木的生长发育起着关键作用。因此，研究树木细根的根际微生物对提高林木生产具有重要意义。以杨树为例，距离树干0-1 m的范围为细根集中分布区，树木根系样品的收集范围在地下5-20 cm内，因为杨树细根主要集中分布在该范围内 (Mulia and Dupraz, 2006; Lacercat et al., 2016)。使用修枝剪剪取细根，每棵树木收集至少10 g根系样品。每个处理组至少5个生物学重复，一般推荐10个生物学重复。
4. 将收集的根系样本分装至无菌采样袋中并做好标记，密封保存。无菌采样袋立即放入生物样品采样箱中低温保存 (采样箱内提前放入冰袋或干冰)。低温运送至实验室进行根际土的收集。
   
   

三、实验室根际土收集

按以下步骤收集根际土：
1. 在超净工作台内抖落根系的bulk soils (即非根际土)，附着在根部约1mm厚的土壤被定义为根际土壤 (图3) (Edwards et al., 2015)。
2. 将根系样品转移至含20 ml无菌10 mM PBS溶液的无菌50 ml离心管中，放置于全温摇床120 rpm/min，室温下震荡20 min (Beckers et al., 2016; Beckers et al., 2017)。
3. 使用无菌镊子 (将镊子放在酒精灯火焰上进行高温消毒，用无菌水冷却至常温后使用) 挑除50 ml离心管中的根系，剩余悬浮液高速离心 (6,000 × g，4 °C) 20 min (秦媛等，2018) 收集根际土壤 (图4)。
4. 收集的根际土壤样品可直接进行后续实验，或液氮速冻后，置于-80 °C超低温冰箱保存。
   
   
   图3. 根际、根表和内生示意图 (图片引自Edwards等, 2015)
   
   
   图4. 根际土分离流程
   
   注意事项：
   
   1. 根系取样，时常会碰到杂质含量较高，取样时需要对杂质进行过滤，避免石块等杂质戳破采样袋等情况的发生，也会给后续提取造成干扰。
   2. 采样时每个采样点的取样深度及采样量应均匀一致。
   3. 根际土收集过程中，摇床震荡时间和强度可根据洗涤难易程度而调整。
   4. 样品保存时避免反复冻融，以免破坏根际土壤菌群结构。
      
   
   

溶液配方

1. 10 mM PBS溶液(w/v)：
   NaCl 130 mM
   Na₂HPO₄ 7 mM
   NaH₂PO₄ 3 mM
   超纯水定容至1 L，调pH 7.4，121 °C高压灭菌15 min，待温度恢复到室温后4 °C保存备用。
   

致谢

    本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目(资助号：31722014)和中央非营利性研究基础研究基金(资助号：CAFYBB2020ZY002-1和CAFYBB2019ZA001-3)的经费支持。

参考文献

1. 秦媛, 潘雪玉, 靳微, 陈连庆 和 袁志林. (2018). 杨树人工林土壤微生物群落4种提取方法比较. 林业科学 54(9)：169-176.
2. 潘雪玉. (2018). 沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探(硕士学位论文,中国林业科学研究院). 
3. Berhongaray, G., Janssens, I. A., King, J. S., and Ceulemans, R. (2013). Fine root biomass and turnover of two fast-growing poplar genotypes in a short-rotation coppice culture. Plant Soil 373(1-2): 269-283.
4. Guo, D., Xia, M., Wei, X., Chang, W., Liu, Y., and Wang, Z. (2008). Anatomical traits associated with absorption and mycorrhizal colonization are linked to root branch order in twenty-three Chinese temperate tree species. New Phytol 180(3): 673-683.
5. Lacercat-Didier, L., Berthelot, C., Foulon, J., Errard, A., Martino, E., Chalot, M. and Blaudez, D. (2016). New mutualistic fungal endophytes isolated from poplar roots display high metal tolerance. Mycorrhiza 26(7): 657-671.
6. Mulia, R. and Dupraz, C. (2006). Unusual fine root distributions of two deciduous tree species in southern France: What consequences for modelling of tree root dynamics? Plant and Soil 281(1-2): 71-85.
7. Norby, R. J., and Jackson, R. B. (2000). Root dynamics and global change: seeking an ecosystem perspective. New Phytol 147(1): 3-12.
8. Edwards, J., Johnson, C., Santos-Medellín, C., Lurie, E., Podishetty, N. K., Bhatnagar, S., Eisen, J. A. and Sundaresan, V. (2015). Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proc Natl Acad Sci U S A 112(8): E911-E920.
9. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Van Acker, R., Van Montagu, M., Boerjan, W., and Vangronsveld, J. (2016). Lignin engineering in field-grown poplar trees affects the endosphere bacterial microbiome. Proc Natl Acad Sci U S A 113(8): 2312-2317.
10. Beckersz, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., and Vangronsveld, J. (2017). Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome 5(1): 25.