Rumen Microbiota Transplantation

材料与试剂

1. 试验动物
2. 瘤胃液采集管 (科立博牧业科技有限公司，catalog number: A1141K、A1164K或A1320K，图1，表1)
   
   
   图1. 瘤胃液采集管 (图片摘自https://www.anscitech.cn/)
   
   表1. 瘤胃液采集管型号及适用范围
   
   
   
3. 密封保温瓶
4. 50 ml离心管
5. 血清瓶
6. CO₂气体
7. 无菌纱布
8. 100~200 ml注射器 (若需要移植的瘤胃液较多，选用相应型号注射器)
9. 250 ml离心杯 (离心机配套)
10. 脱脂奶粉
11. 瘤胃插管
    羔羊采用鼻饲管 (Freka Tube, catalog number: 7980111，图2)；牛或成年羊采用瘤胃液采集管。
    
    
    图2. Freka Tube鼻饲管
    
    
12. PBS磷酸缓冲液
13. 冻干保护剂 (见溶液配方)
14. 碳水化合物厌氧固体培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 水浴锅
2. 高速离心机
3. 真空冷冻干燥机
4. -80 °C超低温冰箱
5. 厌氧培养箱
   

实验步骤

1. 瘤胃液移植 (图3)
   1.1

   供体动物的选择
   选取5头或以上健康供体反刍动物。供体筛选原则如下：

   1)

   大于5月龄

   2)

   体温38-39.5 °C (直肠温度)

   3)

   自由采食和饮水

   4)

   采食、排泄、呼吸、社交、繁殖等日常行为均无异常

   5)

   外观无伤

   6)

   瘤胃内环境正常，无酸中毒、胀气等

   7)

   精神行为正常

   8)

   无其他异常行为

   9)

   2周内未使用抗生素，且未接种活的病毒疫苗

   10)

   无腹泻、便秘、便血等情况

   11)

   未接触其他患病的动物

   12)

   经血清学检测，无动物疾病，在移植过程中无传播传染病的风险
   将供体反刍动物按照试验要求进行14天预饲，以富集瘤胃微生物，减少个体差异。预饲期间不得使用抗生素。
   1.2

   供体瘤胃液的采集
   于瘤胃液移植当天晨饲前，使用瘤胃采集管通过口腔采集供体动物的瘤胃液 (视频1)。弃去前100 ml瘤胃液 (防止唾液污染)，随后收集的瘤胃液于密封保温瓶中暂存。待所有供体动物瘤胃液采集完毕后，在CO₂气流保护下，将所有供体瘤胃液等体积混合。混合后的瘤胃液经四层纱布过滤，用离心管或血清瓶密封，置于39 °C水浴备用。
   
   

   

   视频1. 口腔采集瘤胃液

   
   
   1.3

   瘤胃液移植到受体动物
   受体动物在瘤胃液移植前1~2周停止使用抗生素。将瘤胃插管经受体动物口腔插入瘤胃中。羔羊采用鼻饲管，将鼻饲管从口腔插入时，羔羊会自动吞咽鼻饲管，帮助插管插入瘤胃，鼻饲管插入30~40 cm，切勿过度插入；成年羊或牛采用瘤胃液采集管插入瘤胃底部，成年羊或犊牛插入约1.2 m，成年牛插入约2 m。用注射器将瘤胃液经瘤胃插管注入。从瘤胃液采集完毕到移植的时间不超过30 min。
2. 瘤胃微生物冻干粉移植 (图3)
   2.1

   瘤胃微生物冻干粉制备 (视频2)
   经四层纱布过滤后的瘤胃液装入250 ml离心杯，并充入CO₂，500 × g室温下低速离心5 min以去除饲料大颗粒。将上清液继续装入离心杯并充入CO₂，24,000 × g室温下高速离心20 min沉淀细菌菌体。弃去上清，加入1,000 ml冻干保护剂重悬菌体，充入CO₂密封后置于-80 °C硬化2 h。使用真空冷冻干燥机将硬化后的菌体冻干，混合所有批次的瘤胃微生物冻干粉备用。
   
   

   

   视频2. 瘤胃液冻干粉的制备

   
   
   2.2

   微生物冻干粉活菌数检测和残留挥发性脂肪酸的测定

   1)

   制备冻干粉的过程中，记录并计算瘤胃微生物冻干粉的平均得率。

   2)

   取0.5 g微生物冻干粉，溶于1 ml PBS缓冲液中，经10倍梯度稀释形成系列微生物溶液。取各浓度微生物溶液20 μl，均匀涂布于碳水化合物厌氧固体培养基上，39 °C下培养48 h。培养后，选择合适稀释浓度下的培养基 (培养皿上菌落数为30~200个)，计算活菌数。

   3)

   取2.5 g冻干粉，溶于10 ml PBS缓冲液，以提取冻干粉中残留的挥发性脂肪酸，使用气相色谱测定挥发性脂肪酸的浓度。
   2.3

   瘤胃微生物冻干粉移植到受体动物
   受体动物在微生物移植前1~2周停止使用抗生素。将瘤胃微生物冻干粉溶于代乳粉或水，随代乳粉或水一起饲喂。溶解时，代乳粉或水的温度为39~40 °C。
   
   
   图3. 瘤胃微生物移植流程图

结果与分析

1. 移植瘤胃液的活菌数
   按照本文方法处理的新鲜瘤胃液的平均活菌数为4.5 × 10⁷ CFU/ml，满足移植要求。
2. 瘤胃微生物冻干粉的得率、活菌数和残留挥发性脂肪酸
   按照本文方法，平均每40 ml瘤胃液可获得1 g瘤胃微生物冻干粉，其平均活菌数为6.8 × 10⁸ CFU/g，冻干粉中残余的乙酸、丙酸和丁酸的浓度依次为15.98 μmol/g、1.97 μmol/g和2.09 μmol/g。
   

溶液配方

1. 冻干保护剂
   称取100 g脱脂奶粉溶于1 L煮沸的蒸馏水，用微波炉中再次煮沸去除溶氧，然后持续通入CO₂冷却备用
2. 碳水化合物厌氧固体培养基
   培养基配方参考Leedle等 (1980)，如表2所示。配制完成后煮沸去除溶氧，通入CO₂气体30~45 min，使培养基变成无色。121 °C高压灭菌15 min，于厌氧培养基中稍稍冷却，加入Na₂S/L-半胱氨酸盐酸盐溶液和Na₂CO₃，倒入培养皿中冷却备用
   
   表2 碳水化合物厌氧培养基配方
   
   ¹碳水化合物: 纤维素、纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖、果胶、可溶性淀粉、木聚糖、木糖 (w/v) 和甘油 (v/v) 各0.05%
   ²矿物质I: 0.6% K₂HPO₄
   ³矿物质II: 0.6% KH₂PO₄、0.6% (NH₄)₂SO₄、1.2% NaCl、0.255% MgSO₄·7H₂O、0.169% CaCl₂·2H₂O
   ⁴血红素溶于50 ml乙醇和50 ml 0.05 M NaOH中
   ⁵每100 ml挥发性脂肪酸溶液包含17 ml乙酸、6 ml丙酸、4 ml丁酸，以及异丁酸、正戊酸、异戊酸和DL-α-甲基丁酸各1 ml，加蒸馏水混匀，用NaOH调节pH至7.5
   ⁶瘤胃液以24,000 × g 离心30 min后储存在-80 °C条件下
   ⁷溶液过0.22 μm Millipore^®滤膜除菌，待培养基高压灭菌后添加
   

致谢

感谢国家重点研发计划 (2017YFD0500502) 和国家自然科学基金 (31622056和31572431) 的资助。使用本试验方案的文章：Yu等 (2020)。

参考文献

1. 胡军, 谢春琳, 唐义梅, 晏向华. (2017). 我国猪粪便微生物移植技术的标准程序初探. 中国畜牧杂志, 53(8): 1-4.
2. Hu, J., Chen, L., Tang, Y., Xie, C., Xu, B., Shi, M., Zheng, W., Zhou, S., Wang, W., Liu, L., Yan, Y., Yang, T., Niu, Y., Hou, Q., Xu, B., Yan, X. (2018). Standardized preparation for fecal microbiota transplantation in pigs. Front Microbiol 9, 1328.
3. Leedle, J. A. and Hespell, R.B. (1980). Differential carbohydrate media and anaerobic replica plating techniques in delineating carbohydrate-utilizing subgroups in rumen bacterial populations. Appl Environ Microbiol 39(4): 709-719.
4. Shen, J. S., Chai, Z., Song, L. J., Liu, J. X. and Wu, Y.M. (2012). Insertion depth of oral stomach tubes may affect the fermentation parameters of ruminal fluid collected in dairy cows. J Dairy Sci 95(10): 5978-5984. 
5. Yu, S., Shi, W., Yang, B., Gao, G., Chen, H., Cao, L., Yu, Z. and Wang, J. (2020). Effects of repeated oral inoculation of artificially fed lambs with lyophilized rumen fluid on growth performance, rumen fermentation, microbial population and organ development. Anim Feed Sci Technol 264.