Major Sampling Sites and Methods of Oral Microbiome

材料与试剂

1. 牙科吸潮纸尖，35#或者40#（柳苑，catalog number：30）
2. 滤纸条（Whatman，catalog number：1004-070）
3. 0.5 ml无菌离心管
4. 1.5 ml无菌离心管
5. 无菌牙科探针
6. 无菌刮匙
7. 牙周刮治器
8. 无菌毛刷
9. 刮板（Stim-U-Dent，Johnson & Johnson）
   

仪器设备

1. 超低温冰箱（-80°C）
2. 低温冰箱（-20°C）
3. 低温高速离心机
   

实验步骤

一、唾液样本的采集（Wong et al., 2008; 周学东等，2009；程广强，2017；Maribasappa et al., 2017）

1. 唾液样本采集时间：一天中不同时间点唾液的流率有所不同，唾液菌斑也会受进食、口腔卫生措施的影响。因此，样本采集建议选择在晨起刷牙之前或两餐之间。
2. 唾液样本采集与转运：唾液样本分为非刺激性唾液和刺激性唾液。刺激性唾液主要用来评估唾液腺的功能，此处不再详细介绍。非刺激性唾液是完全处于生理自然条件下收集的样本，大多数微生物组研究选择非刺激性唾液作为研究样本。非刺激性唾液样本采集的方法有两种：方法一，受试者手持唾液收集容器；静坐，低头，口微张、睁开眼、头微微前倾；避免吞咽，先将唾液聚集在口底，再吐到容器内。方法二，受试者手持唾液收集容器；静坐，低头，口微张、睁开眼、头微微前倾；避免吞咽，使唾液自然流入唾液收集容器中。两种方法通常耗时5-10 min。最后，将样本置于冰盒中转运。
3. 唾液样本的处理：将收集的唾液分装入1.5 ml无菌离心管中，低温离心（≥16,200× g，4℃，15 min），吸取上层清亮液体入另一1.5 ml无菌离心管内（可用于其他研究），沉淀可用于微生物检测分析。
4. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。
   
   
   

二、牙面菌斑样本的采集（Nascimento et al., 2019；Peterson et al., 2013；Corby et al., 2005）
以下操作在口腔治疗牙椅上进行，注意采样器材需满足无菌要求。

1. 采样前准备：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣。
2. 样本采集与转运：首先，用无菌棉球隔湿。用无菌探针/匙形刮治器刮取目标牙面的菌斑样本，收集到0.5 ml无菌离心管中；也可以使用无菌小毛刷（Peterson et al., 2013）或刮板（Corby et al., 2005）收集牙面菌斑，然后在准备好的缓冲液中荡洗1min将样本洗脱下来。最后，将收集的样本放入冰盒中转运。（单个位点的样本可用以研究该位点的微生物组；多个指数牙的集合样本可用以研究患者水平的微生物组；具有相同临床特征的多个位点的集合样本可用以研究该临床特征所对应的微生物组）
3. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

三、龋损菌斑样本的采集（肖晓蓉, 1993；Nascimento et al., 2019）
以下操作在口腔治疗牙椅上进行，注意采样器材需满足无菌要求。

1. 采样前准备：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣。
2. 样本采集与转运：首先，用无菌棉球隔湿取样位点。不同部位牙菌斑的采集方式有所不同：咬合面沟裂菌斑一般使用无菌探针采集；邻面菌斑可使用探针、牙线或正畸用细钢丝；根面龋的菌斑样本可用无菌刮匙；龈上或龈缘菌斑样本使用无菌匙形器采集。将菌斑收集到0.5 ml无菌离心管中，冰盒转运。（单个位点的样本可用以研究该位点的微生物组；多个指数牙的集合样本可用以研究患者水平的微生物组；具有相同临床特征的多个位点的集合样本可用以研究该临床特征所对应的微生物组）
3. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

四、龈下菌斑和种植体周黏膜下菌斑样本的采集（肖晓蓉, 1993；do Nascimento et al., 2011；Lu et al., 2019；Zheng et al., 2015）
以下操作在口腔治疗牙椅上进行，注意采样器材需满足无菌要求。龈下菌斑、种植体周黏膜下菌斑常用的方法有：刮匙法和吸附法（滤纸条/吸潮纸尖）。两种方法通常选择其中一种。取样位点常选用目标牙位的近中颊侧和远中颊侧，能尽量避免唾液污染，取样难度较小。

1. 采样前准备：样本采集之前请受检者用清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣。用探针刮除牙面龈上菌斑和软垢后，用无菌棉球隔湿。
2. 样本采集与转运：
   吸附法：用无菌镊子将吸潮纸尖（剪掉尖端0.5-1 cm）（陈智滨等，2008；do Nascimento et al., 2011）或滤纸条（2*10 mm）（Guentsch et al., 2011）沿牙面插入牙周袋内遇阻力停置30 s取出，放入0.5 ml无菌离心管中，冰盒转运。
   刮匙法：用无菌的牙周刮治器取牙周袋内的龈下菌斑（Lu et al., 2019）或种植体周黏膜下菌斑（Zheng et al., 2015），放入0.5 ml无菌离心管中，冰盒转运。
   （单个位点的样本可用以研究该位点的微生物组；多个指数牙的集合样本可用以研究患者水平的微生物组；具有相同临床特征的多个位点的集合样本可用以研究该临床特征所对应的微生物组）
3. 吸附法采集的样本，需要采用套管法进行洗提，具体方法如下：向装有无菌吸潮纸尖或滤纸条样本的0.5 ml离心管中加入100 μl缓冲液，常温荡洗30-60 min。将该0.5 ml离心管倒置，在底部中央用烧红的针尖快速刺入并拔出，形成一个小孔（＜吸潮纸尖/滤纸条直径）。将上述0.5 ml离心管放入1.5 ml无菌离心管中，对称放入低温高速离心机内进行离心（≥16,200 × g，4℃，15 min）。轻轻吸取上清置入另一离心管中留存，沉淀则为菌斑样本。
4. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

五、根管内菌斑样本的采集（周学东等，2009；Parahitiyawa et al., 2015）
感染根管内菌斑样本通常采用无菌纸尖采样法，以下操作在口腔治疗牙椅上进行，注意采样器材需满足无菌要求。

1. 采样前准备：取样前去除牙冠上的食物残渣、牙石、菌斑、软垢等，以免造成污染。另外，取样需要开放髓腔，获取根管入路（注意应尽量避免大量冲水造成的菌斑破坏）。
2. 样本采集与转运：用无菌棉球隔湿。将无菌吸潮纸尖，插入根管内，静置一段时间（通常30 s），取出，放入0.5 ml无菌离心管中，冰盒转运（周学东等，2009）。（单个位点的样本可用以研究该位点的微生物组；多个指数牙的集合样本可用以研究患者水平的微生物组；具有相同临床特征的多个位点的集合样本可用以研究该临床特征所对应的微生物组）
3. 样本处理：同上（套管法）。
4. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

六、舌背菌斑样本采集（周学东等，2009；Iwauchi et al., 2019）

1. 采样前准备：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣。
2. 样本采集与转运：受试者微张口、伸舌，用无菌毛刷从舌背一侧呈叠瓦状刷到另一侧，将含有样本的毛刷部分剪下，放入无菌管内。
3. 样本处理：加入缓冲液荡洗。将毛刷从液体中取出，低温离心（≥16,200× g，4℃，15 min），轻轻吸取弃去上清，沉淀为舌背菌斑样本。
4. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

七、其他黏膜表面菌斑样本的采集（Datar et al., 2013；Kullaa et al., 2014）
口腔内的其他黏膜表面菌斑取样位点主要包括：颊黏膜、上颚等。

1. 采样前准备：取样前请受检者清水漱口，去除口中可能含有的食物残渣。
2. 样本采集与转运：用无菌木板刮取或棉拭子擦取黏膜表面的菌斑，放入配套的无菌管中，在装有缓冲液的管中反复荡洗（Datar et al., 2013；Kullaa et al., 2014）。留取荡洗后的液体，冰盒转运。
3. 样本处理：低温离心（≥16200 × g，4℃，15 min），轻轻吸取弃去上清，沉淀为舌背菌斑样本。
4. 样本贮存：短期（1个月）内可存放于-20°C冰箱；长期贮存需置于-70°C超低温冰箱中（后续用于细菌培养的话，需加入甘油、DMSO等冷冻保护剂）。

八、其他口腔菌斑样本的采集
口腔内常出现的脓肿有：牙周脓肿、根尖周脓肿、种植体周粘膜溢脓等。若分泌量较大可用无菌注射器吸取（周学东等，2009）；若分泌量较小可选用滤纸条或无菌吸潮纸尖吸取（Wang et al., 2020）。

参考文献

1. 程广强. (2017) 口腔癌患者唾液及尿液中游离芳香族氨基酸的检测方法及应用研究, 福建分析测试, 26(4): 7-15.
2. 吴亚菲，张举之. (1995) 牙周炎患者附着菌斑和非附着菌斑的比较, 牙体牙做牙周病学杂志, 1(5): 13-15.
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4. 周学东，肖丽英，肖晓蓉. (2009) 实用口腔微生物学与技术，人民卫生出版社.
5. 陈智滨，孙晓军，栾庆先 （2008）滤纸条与吸潮纸尖采集龈沟液样本比较，现代口腔医学杂志， 22（2），137-140.
6. Corby, P. M., Lyons-Weiler, J., Bretz, W. A., Hart, T. C., Aas, J. A., Boumenna, T., Goss, J., Corby, A. L., Junior, H. M., Weyant, R. J. and Paster, B. J. (2005) Microbial risk indicators of early childhood caries. J Clin Microbiol, 43, 5753-5759.
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