Collection and Preparation of Microbiota Samples in Shrimp Culture System

材料与试剂

1. 无菌一次性培养皿
2. 无菌药匙
3. 无菌牙签
4. 一次性无菌刀片
5. 无菌剪刀、镊子
6. 无菌无酶EP管（2 ml 和5 ml，Axygen Scientific公司，Axygen）
7. 无菌无酶移液器吸头（20 μl、200 μl和1,000 μl，Axygen Scientific公司，Axygen）
8. 一次性橡胶手套
9. 160目筛绢（孔径约100 μm， Honeywell International，Honeywell，产品目录号：gAM5A）
10. 聚碳酸酯膜（0.22 μm，Merck Millipore，Isopore，产品目录号：GTTP02500）
11. 采样瓶（体积为1 L，2 L或5 L）
12. 滤液收集瓶（体积为1 L）
13. 无磁不锈钢漏斗（直径为140 mm）
14. 玻璃烧杯（500 ml）
15. 研钵
16. 75%酒精
17. 1x TE 缓冲液（生工生物工程（上海）股份有限公司，生工，产品目录号：B548106-0500）
18. 无水乙醇
19. 无菌去离子水
20. 液氮
21. 二氧化氯泡腾片（河南省南华千牧生物科技有限公司，南华千牧，产品目录号：45632）
22. DNeasy^® Power Soil^® Kit（QIAGEN公司，Qiagen，产品目录号：12888）
23. QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN公司，Qiagen，产品目录号：51506）

仪器设备

1. 有机玻璃采水器（长垣县新长源塑业制品厂，体积为5 L）
2. 旋片式真空泵（浙江飞越机电有限公司，飞越，产品型号： FY-1HN）
3. 真空过滤装置（Thermo公司，Nalgene，产品型号：300-4100）
4. 单道移液器（Eppendorf公司，Research plus）
5. 车载冰箱（河南新飞电器集团有限公司，新飞，产品型号：TF-L5D）
6. -80°C超低温冰箱（Thermo公司，Thermo，产品型号：902991）
7. 研磨均质破碎仪（Bertin Technologies公司，Precellys，产品型号：P000671-CLYS1-A）
8. 涡旋振荡器（Scientific Industries 公司，Vortex Genie 2，产品型号：SI-0246）
9. 小型台式冷冻离心机（Eppendorf公司，Eppendorf，产品型号：5424R）
10. 微量核酸测定仪（Thermo Scientific公司，产品型号：NanoDrop 2000，产品型号：ND-2000）
11. 核酸定量荧光计（Thermo Scientific公司，产品型号：Qubit™ 4 Fluorometer，产品型号：Q33327）
    

实验步骤

一、凡纳滨对虾高位池养殖系统微生物样品的采集和制备
本文以典型凡纳滨对虾高位池养殖系统为例（图1），介绍该养殖系统中微生物样品的采集和制备流程（该流程同样适用于土塘生态池、生物絮团养殖池等对虾养殖系统）。养殖期间采集对虾消化道（Xiong et al., 2015；Liu et al., 2019；Guo et al., 2020）和水体（Zhang et al., 2014；Liu et al., 2018；杨坤杰等，2016）微生物样品，具体流程如下：

图1. 实验用对虾养殖高位池

a.高位池对虾消化道微生物样品的采集和制备

1. 对虾消化道组成。对虾消化道主要包括贲门胃、幽门胃、肝胰腺、中肠和后肠（图2）。
   
   
   图2. 凡纳滨对虾消化道组成图（改编自网络）
   
   
2. 对虾样品采集及前处理。每池随机采集10只对虾，先用75%酒精的棉球擦拭对虾体表，再用一次性无菌刀片沿头胸甲下部将虾体切开，虾体上部用于采集肝胰腺和胃样品，下部分用于采集肠道样品。
3. 肝胰腺样品采集。用无菌镊子剥开头胸甲，再用另一把镊子从切口处取出肝胰腺，装入2 ml EP管中，5个肝胰腺混合成一个样品。
4. 胃样品采集。用无菌镊子夹取出整个胃（贲门胃、幽门胃），装入2 ml EP管中，5个胃混合成一个样品。
5. 肠道样品采集。用一次性无菌刀片沿对虾背部划开，用无菌牙签挑取出肠道（中肠和后肠），装入2 ml EP管中，5个肠道混合成一个样品。
6. 样品保存。样品收集后迅速置于液氮中，运回实验室后转入-80°C超低温冰箱保存，并尽快提取DNA。
7. 对虾消化道微生物组DNA提取。将样品从超低温冰箱取出，用无菌药匙取约0.1 g样品，采用QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒分别提取肝胰腺、胃、肠道微生物组DNA（具体操作步骤见附录1）。

b.高位池水体微生物样品的采集和制备

1. 采集器具灭菌。1）高压蒸汽灭菌：将剪刀、镊子、筛绢和去离子水等在121°C条件下高压灭菌20 min。2）表面消毒：有机玻璃采样器、采样瓶、滤液收集瓶、无磁不锈钢漏斗、真空抽虑装置等，使用前先用50 mg/L的二氧化氯溶液浸泡5 min，再用无菌去离子水润洗2次。
2. 水样采集。每个养殖池选取4个采样点（图3），用有机玻璃采水器分别采集各点水面下50 cm的养殖水体500 ml，装入2 L采样瓶中。
   
   
   图3. 养殖池采样点示意图
   
   
3. 水样预过滤。采集的水样预先用160目的灭菌筛绢过滤（图4），去除大型浮游动植物和大颗粒悬浮物，滤液收集到1 L滤液收集瓶。
   
   
   图4. 养殖水样的预过滤装置
   
   
4. 水样运输。将预过滤后的水样放入车载冰箱或冰盒尽快运回实验室，一半用于收集微生物样本，一半用于测定水化学指标。
5. 抽滤装置的安装。连接旋片式真空泵、真空过滤装置、橡胶管、气管、开关阀门等装置（图5），并加装0.22 μm的聚碳酸酯膜。安装前，过滤装置中的抽滤瓶和漏斗预先用去离子水冲洗3次。
   
   
   图5. 养殖水样微生物的过滤收集装置
   
   
6. 微生物样本的收集。在过滤装置的漏斗中加入200~500 ml的水样（同一批次过滤水量应相同），启动抽滤泵，水样抽滤完后再抽滤1 min，使滤膜完全干燥。每瓶水样收集3张富集微生物的滤膜。
7. 样品保存。用无菌镊子将富集微生物的滤膜装入5 ml EP管，迅速置于液氮中，之后转至-80°C超低温冰箱保存，并尽快提取DNA。微生物组DNA提取。用无菌镊子将滤膜取出放置在培养皿中，用无菌剪刀将滤膜尽可能剪碎；用无菌镊子将滤膜转移至-4°C预冷的PowerBead Tubes中（试剂盒提供），并使用DNeasy^® Power Soil^® Kit提取水体微生物组DNA（具体操作步骤见附录2）。

二、对虾育苗系统微生物样品的采集和制备
凡纳滨对虾幼体发育包括无节幼体（nauplius）、蚤状幼体（zoea）、糠虾幼体（mysis）和仔虾早期（early postlarvae）四个阶段（图6）。由于对虾幼体较小，很难从虾体中分离完整的肠道，因此采集整只虾体测定微生物组。本文以标准化温室育苗体系（4 m × 5 m × 1.3 m，图7）为例，介绍该体系中微生物样品的采集与制备，具体步骤如下（参考Zheng et al., 2017, Xue et al., 2018, Duan et al., 2020，Wang et al., 2020）：

1. 水样采集。用有机玻璃采水器在育苗池的四周分别采集500 ml水体（采样点参考图2），装入2 L无菌采样瓶中，混合均匀。
2. 对虾幼体微生物样品采集。用160目灭菌筛绢过滤水样，对虾幼体被截留在筛绢上，用无菌药匙将它们收集于500 ml无菌烧杯中，用灭菌海水冲洗3次。用药匙将幼体转入2 ml EP管，4°C 100 × g离心1 min，用移液器吸出上层液体，获得的沉淀即为对虾幼体样品，每个样品约收集0.5 ~1.0 g幼体。
3. 育苗水体微生物样品收集。经步骤2过滤的水样，用于收集水体微生物（操作步骤同“高位池水体微生物样品的采集和制备”）。
4. 样品保存。将收集到的对虾幼体和水体微生物样品保存于液氮中，运回实验室后转入-80 °C超低温冰箱，并尽快提取DNA。
5. 对虾幼体微生物组DNA提取。在灭菌后的研钵中加入液氮，将幼虾样品研磨成粉状。取0.2 g研磨后样品，使用QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取对虾幼体微生物组DNA（具体操作步骤见附录1）。
6. 育苗水体微生物组DNA提取。具体操作参考“高位池水体微生物样品的采集和制备”步骤7。
   
   
   图6. 幼虾发育的不同阶段示意图 (改编自网络)
   
   
   图7. 标准化对虾温室育苗池

三、生物絮团微生物样品的采集和制备
本文以代表性生物絮团养殖系统为例（图8），介绍该养殖系统中生物絮团微生物样品的采集和制备过程（Huang et al., 2020），具体步骤如下：

1. 水样采集。用有机玻璃采水器在生物絮团养殖池的四周分别采集500 ml水体（采样点参考图2），装入2 L无菌采样瓶中，混合均匀。
2. 生物絮团收集。用量筒量取1 L水样，用160目灭菌筛绢过滤，截留在筛绢上的即为大粒径生物絮团（> 100 μm）；如需收集较小粒径的生物絮团（例如20~100 μm），则用滤膜（例如20 μm）继续过滤以上滤液，滤膜上收集的即为小粒径的生物絮团。
3. 样品保存。用无菌药匙刮取生物絮团，分装到3个2 ml EP管中，并迅速置于液氮中，运回实验室后转入-80°C超低温冰箱保存。
4. DNA提取。从超低温冰箱取出生物絮团样品，加入100 μl TE缓冲液后，置于4°C冰箱解冻，4°C 100 × g离心2 min，用移液器吸出上层液体，得到纯净的生物絮团样品。用药匙取0.1 g生物絮团样品，采用DNeasy^® Power Soil^® Kit试剂盒提取生物絮团微生物组DNA（具体操作步骤见附录2）。
   
   
   图8. 生物絮团养殖池与生物絮团

结果与分析

按照本实验流程进行微生物样本的收集和DNA提取，可以得到DNA完整性和纯度较高的样本。合格DNA样品结果如下：1）琼脂糖凝胶电泳显示DNA样本条带单一且明显或轻微弥散，无明显或轻微降解，无或轻微杂质和RNA污染，无或轻微杂带和胶孔滞留，（图9A）；2）采用Qubit™ 4核酸定量荧光计测定核酸浓度，核酸浓度 ≥ 20 ng/ul，核酸总量≥10 ug，1.6 < OD 260/280 < 2.0， OD 260/230 > 2.0。不合格样品结果为：琼脂糖凝胶电泳显示DNA样本条带出现严重降解或杂质污染且主条带不明显（图9B）；核酸总量 ≤ 0.2 ug。


图9. DNA电泳结果。A：合格DNA样本，条带自左至右依次为5,000 bp DNA marker，水体样本、消化道样本、幼体样本和絮团样本的微生物基因组DNA；B：不合格样本的DNA

失败经验

1. 取样过程中可能因样本微生物生物量过少导致DNA总量不足，导致制备的样品不合格。此时可以提取备样样品DNA后，混合浓缩后重新检测DNA质量。
2. 若DNA样品在琼脂糖凝胶上主条带明显，但有杂质污染，可以再次进行过柱纯化（具体操作步骤见附录2: 步骤14-22）；若DNA降解严重，可提取备样样品DNA，重新进行检测。因此建议在样品采集阶段额外准备2-4份备样，防止意外情况发生。
   

致谢

本工作承国家863项目（2012AA092001）、国家自然科学基金（31672658）、宁波市农业重大专项（2017C110001）、浙江省自然科学基金（LY18C030002）和浙江省教育厅科研项目（Y201839299）的资助。感谢王凯、熊金波、路正、陈和平和王一农老师对本工作的指导和帮助；感谢宁波大学张德民教授课题组历届同学，特别是从事对虾微生物组研究的裘钱玲琳、吴金风、郑嘉来、胡常巨、杨坤杰、刘紫丹、陈伟、刘佳佳、王思鹏、杜世聪等同学对该方法的持续完善。

参考文献

1. 杨坤杰, 王欣, 熊金波, 裘钱玲琳, 黄雷, 张化俊, 郭安南, 李来国, 张德民 (2016). 健康和患病凡纳滨对虾幼体消化道菌群结构的比较. 水产学报 40(11):1765-1773.
2. Guo, H., Huang, L., Hu, S., Chen, C., Huang, X., Liu, W., Wang, S., Zhu, Y., Zhao, Y., and Zhang, D. (2020). Effects of carbon/nitrogen ratio on growth, intestinal microbiota and metabolome of shrimp (Litopenaeus vannamei). Front Microbiol 11: 652.
3. Huang, L., Guo, H., Chen, C., Huang, X., Chen, W., Bao, F., Liu, W., Wang, S., and Zhang, D. (2020). The bacteria from large-sized bioflocs are more associated with the shrimp gut microbiota in culture system. Aquaculture 523: 735159.
4. Liu, J., Wang, K., Wang, Y., Chen, W., Jin, Z., Yao, Z., and Zhang, D. (2019). Strain-specific changes in the gut microbiota profiles of the white shrimp Litopenaeus vannamei in response to cold stress. Aquaculture 503: 357-366.
5. Liu, Z., Qiuqian, L., Yao, Z., Wang, X., Huang, L., Zheng, J., Wang, K., Li, L., and Zhang, D. (2018). Effects of a commercial microbial agent on the bacterial communities in shrimp culture system. Front Microbiol 9: 2430.
6. Wang, Y., Wang, K., Huang, L., Dong, P., Wang, S., Chen, H., Lu, Z., Hou, D., and Zhang, D. (2020). Fine-scale succession patterns and assembly mechanisms of bacterial community of Litopenaeus vannamei larvae across the developmental cycle. Microbiome 8(1): 106.
7. Xiong, J., Wang, K., Wu, J., Qiuqian, L., Yang, K., Qian, Y., Zhang, D. (2015). Changes in intestinal bacterial communities are closely associated with shrimp disease severity. Appl Microbiol Biotechnol 99(16): 6911-6919.
8. Xue, M., Wu, L., He, Y., Liang, H., and Wen, C. (2018). Biases during DNA extraction affect characterization of the microbiota associated with larvae of the Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. PeerJ 6: e5257.
9. Zhang, D., Wang, X., Xiong, J., Zhu, J., Wang, Y., Zhao, Q., Chen, H., Guo, A., Wu, J., and Dai, H. (2014). Bacterioplankton assemblages as biological indicators of shrimp health status. Ecol Indicat 38: 218-224.
10. Zheng, Y., Yu, M., Liu, J., Qiao, Y., Wang, L., Li, Z., Zhang, X., and Yu, M. (2017). Bacterial community associated with healthy and diseased Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae and rearing water across different growth stages. Front Microbiol 8: 1362.
    
    

附录1：

QIAamp^® Fast DNA Stool Mini Kit操作步骤

1. 取180~220 mg (根据需要样品量可增加) 新鲜或冷冻粪便样品 (或液氮研磨后的样品) 放入预冷的2 ml的含砂柱中。
2. 加入1 ml InhibitEX Buffer，涡旋10 s，细胞破碎仪震荡1 min (4,000次/分钟)。
3. 70°C水浴5 min，使细胞充分裂解。
4. 13,500 × g离心1 min，使DNA (上清液) 和破碎的细胞分离 (沉淀物)。
5. 在新的1.5 ml EP管中加入25 μl蛋白酶K。
6. 取步骤4离心后的上清液400 μl加入到含蛋白酶K的EP管中。
7. 加入400 μl Buffer AL，涡旋15 s。
8. 70°C水浴10 min，5 min时取出震荡混匀后继续水浴。
9. 加入400 μl无水乙醇，涡旋混匀。
10. 吸取上述裂解液600 μl加入到预先写过标签的QIAamp自旋柱中，18,400 × g离心1 min；小心取出QIAamp柱，加入到新收集管1中，弃去滤液。
11. 重复以上步骤，将QIAamp柱加到新收集管2中，把剩余裂解液加入到QIAamp柱中。
12. 小心打开QIAamp柱盖子，加入500 µl Buffer AW1，18,400 × g离心2 min。取出QIAamp柱套入新的收集管3中，弃去滤液。
13. 小心打开QIAamp柱盖子，加入500 µl Buffer AW2，18,400 × g离心3 min，弃去滤液。
14. 取出QIAamp柱套入新的收集管4中，18,400 × g空管离心3 min，弃去滤液。
15. 取出QIAamp柱套入新的1.5 ml EP管中，加入100 µl Buffer ATE，室温静置2 min，18,400 × g离心2 min。
16. 将步骤15的离心液再次加入到QIAamp柱中，室温静置2 min，18,400 × g离心3 min，弃去QIAamp柱，得到最终纯化的DNA，置于-20°C保存。
    

附录2：

DNeasy^® Power Soil^® Kit操作步骤

1. 将装有水体微生物滤膜的EP管从-80°C冰箱取出，插入冰盒中。
2. 用无菌镊子将滤膜取出放置在无菌培养皿中，用无菌剪刀将滤膜尽可能剪碎，再用无菌镊子把破碎滤膜加入到PowerBead Tµbes中。
3. 轻轻涡旋混匀10 s。
4. 检测C1溶液质量。若出现沉淀，60°C水浴至全溶解。
5. 加入60 μl C1溶液，上下颠倒数次混匀。
6. 把PowerBead Tubes固定在细胞破碎仪中，在4,000次/分钟下震荡1 min。
7. 室温13,500 × g离心5 min。
8. 转移上清液至一个干净的2 ml Collection Tube中。
9. 加入250 μl C2溶液到上清液中，涡旋混匀8 s。4°C孵育5 min。
10. 室温13,500 × g离心1 min。
11. 转移≤ 600 μl的上清液到一个新的收集管中。
12. 加入200 μl C3溶液到上清液中，涡旋混匀8 s。4°C孵育5 min。
13. 室温13,500 × g离心1 min。
14. 转移≤ 750 μl的上清液到新的收集管中。
15. 收集管中加入1,200 μl C4溶液 (注意使用前混匀)，涡旋混匀5 s。
16. 吸取约675 μl的上清液到Spin Filter中，室温13,500 × g离心1 min。弃去滤液。重复两次直至过滤完所有上清液。
17. 加入500 μl C5溶液到Spin Filter中，室温13,500 × g离心45 s。
18. 弃去滤液，室温13,500 × g离心1 min。
19. 转移Spin filter到2 ml Collection Tube中。
20. 加入50 μl C6溶液到Spin Filter的滤膜中心，室温静置2~3 min，室温13,500 × g离心45 s
21. 将洗脱后的C6溶液再加至Spin Filter的滤膜中心，室温静置2~3 min，室温13,500 × g离心45 s。
22. 弃去Spin Filter，得到最终纯化的DNA，置于-20°C保存。