Sample Collection and Nucleic Acid Extraction of Pit Mud

材料与试剂

1. 厌氧产气袋 (MGC/三菱瓦斯化学，catalog number: C-11) 
2. 自封袋 (Asone/亚速旺，catalog number: ASO-4-536-07) 
3. 枪头 (碧云天Beyotime, catalog numbers: FTIP010, FTIP200, FTIP01C) 
4. 离心管 (Nest/耐思，catalog numbers: 602052, 620011, 615001) 
5. Parafilm封口膜 (Parafilm, catalog number: PM996) 
6. 玻璃珠 (425~600 μm) (Solarbio/索莱宝，catalog number: G8080-100g) 
7. 10% SDS Solution (Macklin/麦克林，catalog number: D885207-250ml) 
8. NaCl (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯)
9. Tris-HCl (pH 8.0) (Macklin/麦克林，catalog number: D885212-250ml) 
10. 三水合乙酸钠 (Macklin/麦克林，catalog number: S817983-500g) 
11. Tris饱和酚 (pH > 7.8) (上海源叶，catalog number: R21022-100ml) 
12. 氯仿 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯) 
13. 异戊醇 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯) 
14. 无水乙醇 (国药集团化学试剂有限公司，中国，分析纯) 
15. RNase A (Solarbio/索莱宝，catalog number: R8021-25) 
16. DEPC水 (上海源叶，catalog number: S30710-500mL) 
17. 琼脂糖 (BIOWEST，catalog number: 111860) 
18. Buffer Z缓冲液 (见溶液配方) 
19. 3 mol/L NaAc溶液 (pH 5.2) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 移液枪 (Eppendorf/艾本德, 货号：3120000267\3120000305\3120000224)
2. 离心机 (Eppendorf/艾本德，model: 5804) 
3. 制冰机 (斯科茨曼，model: AF103AS) 
4. 超低温冰箱 (THERMO/赛默飞，model: ULTS1490) 
5. BeadBeater珠磨式研磨器 (Biospec, catalog number: 3110BXEUR) 
6. 电泳仪 (Bio-Rad/伯乐，catalog number: 164-5050) 
7. 凝胶成像仪 (MIULAB/米欧仪器，catalog number: GIS-500) 
8. NanoDrop 8000分光光度计 (THERMO/赛默飞，catalog number: YQ1633128264) 
9. pH计 (Asone/亚速旺，catalog number: C1-054-01)
   

实验步骤

一、窖泥样品采集

以浓香型白酒窖池为例，分别采集窖壁、窖底三个不同空间位置的窖泥。为消除窖池不同位置窖泥的异质性，每个位置取不同位置的三个样品为对照，取样点示意图如图1。为了尽量保证窖泥厌氧状态，窖泥打孔采集后尽快放入装有厌氧产气袋的自封袋中。每个点取20 g样品。

图1. 窖池窖泥样品采集示意图
1~3为窖壁上部窖泥，4~6为窖壁中部窖泥，7~9窖池底部窖泥。

二、窖泥DNA的提取

1. 取1 g窖泥样品，悬浮于1 ml buffer Z溶液中。
2. 混匀后，转移到加有0.3 g玻璃珠 (425~600 μm) 的螺帽管中，加入150 μl苯酚，beadbeater细胞破碎仪以最大速度 (3,000 × g ) 击打4 min (每击打80 s，将螺帽管置于冰浴中1 min，共击打三次) 。
   注：此步骤注意戴手套操作，防止苯酚伤害皮肤。此步骤后所有操作要轻柔，以防DNA链断裂。
3. 击打后加入110 μl 10% SDS，轻轻颠倒混匀后，冰浴10 min，每5 min轻轻颠倒摇匀。
4. 加入150 μl氯仿:异戊醇 (24:1) 溶液，轻轻混匀，于10,000 × g 离心10 min，吸取上清 (800 μl) ，加入1/10体积的3 mol/L NaAc。
   注：务必不要吸取中间混浊物。
5. 用等体积的酚、酚:氯仿混合液和氯仿各抽提一次，于10,000 × g 离心10 min，吸取上清 (700、600、500 μl) 。
6. 加入2倍体积的冰无水乙醇，于-20 °C沉淀2 h以上，10,000 × g 离心15 min，弃上清。
7. 沉淀于真空冷冻干燥后溶于30 μl无菌水中，加入 20 mg/ml RNase A 3 μl, 37 °C保温15 min；用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组质量及片段长度，核酸浓度测定仪 (NanoDrop 8000分光光度计) 测定DNA浓度，-20 °C保存，可用作PCR反应及高通量测序的模板。
   

溶液配方

1. Buffer Z缓冲液
   配制成终浓度为150 mmol/LNaCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 的混合溶液，灭菌后备用。
   
2. 3 mol/L NaAc溶液 (pH 5.2)
   称取408.1 g NaAc·3H₂O，溶于约800 ml水中，用冰HAc调节pH值至5.2，加水定容至1,000 ml。
   

致谢

感谢江南大学酿造微生物与应用酶学研究室的各位老师、同学对本实验方法的帮助和改进。本方法改编自博士论文 (王雪山，2018) ，已在多篇论文中应用 (Wang et al., 2017; Wang et al., 2018) 。

参考文献

1. 王雪山. (2018). 不同环境清香类型白酒发酵微生物种群结构比较及溯源解析. 江南大学.
2. Wang, X., Du, H. and Xu, Y. (2017). Source tracking of prokaryotic communities in fermented grain of Chinese strong-flavor liquor. Int J Food Microbiol 244: 27-35.
3. Wang, X., Du, H., Zhang, Y. and Xu, Y. (2018). Environmental Microbiota Drives Microbial Succession and Metabolic Profiles during Chinese Liquor Fermentation. Appl Environ Microbiol 84(4): e02369-02317.