Establishment of Nanoantibody/ Staphylococcal Enterotoxin B Interaction Detection Method Based on Surface Plasmon Resonance (SPR) Sensor

实验背景

实验通过氨基偶联在芯片表面固定SEB作为配体，流经Nb浓度梯度作为分析物，通过表面等离子体共振（SPR）技术检测Nb/SEB的相互作用，可获得结合与解离过程中的动力学信息，为后续Nb/SEB结合机制的研究提供线索与佐证。
在表面等离子体共振（SPR）实验中，配体密度是一个至关重要的参数，直接影响实验的灵敏度和结果的可重复性。配体密度过高可能导致空间位阻效应，阻碍分析物与配体的有效结合，甚至引发非特异性吸附，干扰数据解读；而密度过低则会降低信号强度，影响检测限和动态范围。因此，优化配体密度是确保SPR实验成功的关键步骤。通过精确控制配体在传感器芯片表面的固定量，可以实现分析物与配体之间相互作用的准确测量，从而获得可靠的动力学和亲和力数据。
在本次工作中，分别在Biacore 8K（cytiva）和S-CLASS（极瞳生命）两台SPR设备上测试同一配体高、中、低密度下的亲和力信息，对比研究不同配体密度下的互作行为。

材料与试剂

1.  SEB及纳米抗体，由Genewiz公司在Escherichia coli strain BL21 (DE3)内表达，蛋白表达纯化方法参见文献1。SEB分子量29 KD，纳米抗体分子量14 KD，新鲜纯化浓缩，浓度为5 mg/mL，储存在PBS缓冲液中。
2. Polariton CD5芯片（极瞳生命，产品目录号：CR1013）
3. 氨基偶联试剂盒（cytiva，产品目录号：BR100050）
4. 缓冲液：10× HBS-P+（cytiva，产品目录号：BR100671）
5. Polariton C5芯片（极瞳生命，产品目录号：PR1011）
6. 10 mM pH4.5醋酸钠缓冲液（极瞳生命，产品目录号：PR2033）
7. 氨基偶联试剂盒（极瞳生命，产品目录号：PR3002）
8. 缓冲液：10× HBS-T（极瞳生命，产品目录号：PR2012）
9. 再生试剂：10 mM pH 2.5 Glycine-HCl（极瞳生命，产品目录号：PR2042）
10. 其他耗材：1.5 mL EP管，1 mL、200 μL、10 μL枪头均为Axygen公司产品。
    

仪器设备

1. SPR分子互作系统（cytiva，仪器型号：Biacore 8K）
2. Biacore Insight评估软件4.08（cytiva）
3. BIAevaluation 软件（cytiva）
4. SPR分子互作系统（极瞳生命，仪器型号：S-CLASS）
5. Polariton SPR Workstation（极瞳生命，SW1001）

实验步骤

一、Biacore 8K搭载CD5芯片测试纳米抗体/SEB相互作用

1. CD5芯片前处理
   Polariton CD5芯片表面由羧甲基葡聚糖共价修饰，可用于氨基偶联固定样品，Biacore 8K机型可兼容使用（图1）。芯片拆封上机后，设定flow cell 1–2，flow rate 30 μL/min，contact time 60s，连续进样3次50 mM NaOH，令表面充分水化后进行后续实验。
   
   
   图1 Polariton CD5芯片
   
   
2. 配体偶联
   用10 mM醋酸-醋酸钠（pH 4.5）缓冲液稀释SEB至0.2 mg/mL，通过氨基偶联将SEB固定在传感芯片 CD5上（Polariton Life）：
   设定Fc = 1–2，使用偶联试剂（EDC + NHS）活化芯片表面420 s；
   设定Fc =2，偶联SEB蛋白420 s；
   设定Fc = 1–2，用1M乙醇胺封闭芯片表面多余活化位点420 s。
   芯片表面SEB偶联密度约6,500 RU。
3. 分析物测试方法
   用1× HBS-P 缓冲液中将不同纳米抗体稀释至 7.8125 nM、15.625 nM、31.25 nM、62.5 nM、125 nM、250 nM 、500 nM 的浓度。流速30 μL/min，contact time 120 s，dissociation 300 s。以single-cycle kinetics模式进行测试，不同样品间以10 mM citrate buffer (pH 2.5)进行芯片表面再生。
4. 数据处理
   得到的传感器图符合single-cycle kinetics 1:1binding模型或heterogeneous ligand模型，使用BIAevaluation软件（cytiva）进行拟合分析。

1. S-CLASS仪器介绍
   S-CLASS由极瞳生命科技（苏州）有限公司自主研发制造，是一款8进样针（16检测通道）的高通量、高灵敏度的SPR分析系统，可根据实验目的搭载不同类型的传感芯片进行分子互作测试分析。仪器构造如图2：
   
   
   图2 S-CLASS分子互作分析系统
   
   
2. 中、低密度配体的偶联
   用10 mM醋酸-醋酸钠（pH 4.5）缓冲液稀释SEB至1、5 μg/mL，通过氨基偶联将SEB固定在C5芯片上（Polariton Life）：
   设定Fc = A-B，使用偶联试剂（EDC+NHS）活化芯片表面420 s；
   设定Fc = B，偶联SEB蛋白420 s；
   设定Fc = A-B，用1 M乙醇胺封闭芯片表面多余活化位点420 s。
   偶联量分别为820、3,000 RU（图3）。
   
   
   图3 SEB氨基偶联sensorgram
   
   
3. 分析物测试方法
   1. 方法设置
      在Polariton SPR Workstation内依次点击Auto Experiment → Kinetics/Affinity → Multi-cycle Kinetics/Affinity。填写实验名称、操作者信息，Conc. Unit选择nM，点击右上角 。
      左键拖拽到分析cycle下，在弹窗内设置inject参数，injection mode选择High，flow cell选择AB，设定flow rate 30μL/min，contact time 100s，Dissociation 300 s（图3）。
      勾选Name 右侧方框（不同通道运行不同样品），在右侧表格依次填写样品名称。勾选Conc.右侧方框（不同cycle运行不同浓度），稀释比例Dilution填2，右侧表格内填写样品最高摩尔浓度后，向左拖动选择计算区域，单击 ，系统将自动计算和填写完整浓度梯度15.6–500 nM。可在样品浓度梯度前设置1–3个0浓度，作为Blank（图4）。
      
      
      图4 Analyte注射参数的设置界面
      
      按同样的方法设置再生。左键拖拽到分析cycle下，在弹窗内设置inject参数，injection mode选择Normal，flow cell选择AB，设定flow rate 10 μL/min，contact time 30 s。
      设置完成后，点击OK保存。单击上方的，进入样品放置步骤。
   2. 样品准备
      软件自动将样品排布在微孔板内（可通过鼠标右键拖拽重新安排）。按照屏幕显示，不同的纳米抗体样品用运行缓冲液HBS-T进行倍比稀释，准备足够体积的样品（如下图，左侧孔板raw1每孔溶液至少应为270 μL）。（图5）
      将96孔板放置在样品盘的指定位置上并锁定，将样品盘送回样品舱，点击close door将自动合上舱门。
      
      
      图5 溶液排布界面
      
      
   3. 运行实验
      鼠标点击上方的，确认运行缓冲液大于系统的最低要求，点击。系统将正式运行动力学分析程序，整个过程耗时约1 h 47min。（图6）
      
      
      图6 实验开始界面
      
      
      
4. 数据处理
   1. 在Polariton SPR Workstation中，点击Evaluation进入数据分析模块，点create new evaluation找到文件，双击打开。软件操作以SEB-Nb8互作为例。
   2. 软件界面默认显示已经扣减过0浓度的sensorgram，可在这个界面完成数据的基本检查。在Thumbnail区域可选择待分析的样品数据，如果哪个浓度的样品检测结果不合适，可以在下方Sample Table中取消此浓度前的，以删除异常浓度。（图7）
   3. 在页面左侧Kinetic/Affinity mode中，选择kinetic。Fit models选择1:1 binding。点击Fit，即可完成拟合。（图7）
      
      
      图7 数据拟合界面

三、结果与数据分析
对比两台SPR仪器检测得到的Nb/SEB互作传感图（图8），可看到结合解离趋势基本一致，且同浓度Nb结合信号的高低与SEB的固定密度呈直接正相关。这证明了SEB有效活性比例在实验中相对固定且检测方法重复性良好。


图8 Nb与SEB相互作用的SPR传感图

使用1:1 binding模型拟合得到Nb/SEB互作动力学参数如表1。相比高密度配体，中、低密度配体水平测得的结合速率（ka）要更快，这是因为降低配体密度有助于减少芯片表面物质迁移效应的限制和分子拥挤效应，令测量到的结合过程更多地反馈分子相互作用过程而非扩散过程。解离速率（kd）一定程度上反映出Nb/SEB复合物的稳定性，高密度配体在芯片表面易引起解离阶段的微观重结合行为，进而导致测得的kd略慢。综上，在动力学分析中，配体固定密度应尽量保持在较低水平，得到更为可靠的动力学数据。

表1 SPR法测定Nb与SEB的结合动力学参数

溶液配方

1. 1× HBS-T
   量取100 mL 10× HBS-T（100 mM HEPES，150 mM NaCl，0.5% v/v Tween 20）加入900 mL 去离子水H₂O配制1× HBS-T溶液
   

实验注意要点

1. 氨基偶联过程有一定风险会影响配体蛋白活性，因此在实际测试中，可根据预富集结果，设计不同固定密度的配体进行互作分析。根据结合信号反向考察不同密度下配体蛋白的活性比例，进而得到更为可靠的分析结果；
2. 蛋白/蛋白互作的体系中，质量传输的限制应被充分考虑。因此，应在满足正常分析的前提下，尽可能降低配体固定密度。
   

致谢

感谢复旦大学丁澦团队在测试样品制备、Biacore 8K测试数据收集分析、研究成果整理撰写方面提供的技术支持和帮助。
使用本实验方案的研究成果“Structural insights into the binding of nanobodies to the Staphylococcal enterotoxin B”已发表在International Journal of Biological Macromolecules。

参考文献

1. Hughes, A. C., Kirkland, M., Du, W., Rasooly, R., Hernlem, B., Tam, C., Zhang, Y. and He, X. (2023). Development of Thermally Stable Nanobodies for Detection and Neutralization of Staphylococcal Enterotoxin B. Toxins (Basel). 15(6): 400. https://doi.org/10.3390/toxins15060400
2. Zong, X., Liu, P., Wang, Z., Zhu, H., Zhong, C., Zhong, P., Jiang, H., Liu, J., Ma, Z., Liu, X., Liu, R. and Ding, Y. (2024). Structural insights into the binding of nanobodies to the Staphylococcal enterotoxin B. Int J Biol Macromol. 276(Pt 2), 133957. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.133957