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SPR-based Target Fishing Method for Active Natural Product Huperzine A

陈 陈锡祥
陈 陈红专
徐 徐见容

Published: Nov 1, 2024 DOI: 10.21769/BioProtoc.1011016 Views: 446

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摘要： 目的：通过在光敏芯片上固定未经过修饰的石杉碱甲（Huperzine A，Hup A）以及使用SPR样品回收技术（SPR recovery）垂钓与Hup A具有相互作用的潜在靶标。方法：通过紫外活化将Hup A固定在光敏芯片上，使用纯的乙酰胆碱酯酶（AChE）验证SPR样品回收技术的可行性；使用总蛋白裂解液进行SPR回收，将回收的样品冷冻干燥浓缩，进一步进行WB、银染和质谱检测。结果：银染可检测到SPR样品回收得到的纯AChE；质谱鉴定中未能检测到Hup A的靶标AChE，但是鉴定到Thbs1和Tubb5等影响细胞增殖、分化和细胞程序性死亡相关的潜在靶标。结论：本文使用紫外产生自由基的原理将未修饰的Hup A固定在光敏芯片上，结合SPR 样品回收技术垂钓到Hup A的潜在靶标，方法可应用于寻找小分子的潜在作用靶标。

Keywords: SPR search 靶标垂钓 search 石杉碱甲 search

材料与试剂

  1. 光敏芯片 (Xantec，产品目录号: UVHC1000M)
  2. 石杉碱甲（MCE，产品目录号：HY-17387）
  3. 乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒（索莱宝，产品目录号：BC2025）
  4. 50 mM NaOH (泰坦生物, 产品目录号: 1310-73-2）
  5. Tris (泰坦生物, 产品目录号: 77-86-1）
  6. 三色预染蛋白（白鲨生物，产品目录号：BL742A）
  7. 4~20%梯度胶（碧云天生物，产品目录号：P0050A）
  8. 快速转膜液（碧云天生物，产品目录号：P0575-10L）
  9. 快速电泳液（碧云天生物，产品目录号：P0562-10L）
  10. Anti-AChE 抗体（生工生物，产品目录号：D194874）
  11. HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（生工生物，产品目录号：D110058）
  12. HRP显影液（美仑生物，产品目录号：MA0186-2）
  13. 考马斯亮蓝染液R250（考染）（生工生物，产品目录号：6104-59-2）
  14. 快速银染试剂盒（银染）（碧云天，产品目录号：P0017S）
  15. BCA试剂盒（碧云天生物，产品目录号：P0012S）
  16. Pierce® IP Lysis Buffer (Thermo，产品目录号：87787)
  17. 1.5 mL离心管（Axygen，产品目录号：MCT-150-C）
  18. T25培养瓶（Thermo，产品目录号：156367）
  19. T75培养瓶（Corning，产品目录号：430641）
  20. 高糖DMEM培养基（上海源培生物，产品目录号：M211125）
  21. FBS（澳范，产品目录号：FBSKM0502）
  22. 青霉素链霉素（上海源培生物，产品目录号：F121107）
  23. L-丙氨酰谷氨酰胺溶液（上海源培生物，产品目录号：39537-23-0）
  24. 0.25% Trypsin-EDTA（1×）（Gibco，产品目录号：25200-072）
  25. 10× PBS（Cytiva，产品目录号：BR100672）
  26. 10× HBS-EP（Cytiva，产品目录号：BR100669）
  27. 1× HBS-EP（见溶液配方）
  28. Pierce® IP Lysis Buffer（见溶液配方）
  29. 1× PBS（见溶液配方）

仪器设备

  1. Biacore T200（Cytiva，产品型号：T200）
  2. 电泳仪电源（BIO-RAD，产品型号：PowerPacTM Basic）
  3. Amersham生物分子成像仪（Cytiva，产品型号： ImageQuantTM 800）
  4. 冷冻干燥机（宁波新芝生物，产品型号：SCIENTZ-12N）
  5. LED紫外线灯（深圳中联，产品型号：365 nm，10 W）
  6. 多功能酶标仪（BMG LABTECH，产品型号：PHERAstar FSX）
  7. 质谱（Thermo Scientific，产品型号：Orbitrap Fusion Lumos）

实验步骤

一、实验前的准备

  1. 配体的准备
    称取石杉碱甲1.0 mg，加入825.4 μL DMSO配制成5 mM储备液。
  2. 待回收总蛋白裂解液的准备
    1. 使用T75细胞培养瓶培养肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（HT22）、小鼠海马神经元细胞系（PC12）细胞，汇合度达到90%左右收取细胞；
    2. 弃去培养液，使用4℃预冷的PBS清洗3遍；
    3. 在冰上加入800 μL IP裂解液 [1]，用细胞刮刀将细胞刮下转移至1.5 mL离心管，混匀；
    4. 在冰上放置10 min, 期间涡旋2次；
    5. 4℃, 13,000× g, 离心10 min；
    6. 弃沉淀物，取上清即为用于回收的总蛋白裂解液。
    注： PMSF与AChE的活性位点结合 [2]，可能会影响到Hup A与AChE的相互作用，因此提取总蛋白的裂解液中不适合含有PMSF，本实验不添加蛋白酶抑制剂并且需要一直保持在4 ℃环境中进行。
  3. Running Buffer的准备
    1× HBS-EP溶液（见溶液配方）。
  4. 其它准备内容
    1. 乙酰胆碱酯酶活性试剂盒检测备选细胞中AChE活性（按照说明书操作进行）。
    2. Western Blot（WB）鉴定AChE。考染定性验证AChE。
    3. 取凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上缓慢摇动，室温染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，可以认为已染色充分。加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，置于摇床上缓慢摇动，室温脱色4～24小时。期间更换脱色液2～4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。拍照留存即可。
      注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。另外，脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
    4. 银染鉴定进行AChE定性验证（按照说明书操作进行）。
  5. 仪器准备
    1. 仪器开机进行常规维护后将缓冲液更换为MQ H2O进行系统冲洗，选择Tools-Prime；
    2. 将仪器左边的缓冲液更换为HBS-EP，芯片更换为光敏芯片，进行系统冲洗，选择Tools-Prime。
    注：更换缓冲液或芯片都需要运行一次prime。
  6. Hup A的紫外固定（小分子配体的偶联）
    1. 选择并运行Run-manual run模式，使用HBS-EP进样60秒，等待30秒，运行3个循环，记录基线值；
    2. 退出光敏芯片，使用MQ H2O冲洗后再装载芯片，进行系统冲洗后重复步骤6a；
    3. 步骤6a-6b重复3次；
    4. 室温（25 ℃），打开LED紫外线灯预热10分钟；
    5. 退出光敏芯片；
    6. 使用PBS将Hup A稀释成200 μM，量取20 μL Hup A滴加在芯片表面。关闭LED紫外线灯，将芯片转移至紫外灯下，距离约2~3 cm，再打开紫外处理5分钟（图1；图2）[3–5]；


      图1 光敏芯片紫外固定装置


      图2 用于装载紫外处理光敏芯片的托盘（基于CM5外壳改造）

    7. 紫外处理结束后，取出芯片，用PBS冲洗；
    8. 将处理后的芯片装载进仪器中，使用HBS-EP进行系统冲洗；
    9. 选择并运行Run-manual run模式，使用HBS-EP进样60秒，等待30秒，运行3个循环，记录基线水平。
    10. 退出光敏芯片，使用MQ H2O冲洗后再装载芯片，进行系统冲洗后重复步骤6i；
    11. 步骤6i-6j重复3次；
    12. 退出芯片，更换为Control组芯片，除不添加Hup A外其它处理与Hup A组相同。
    注：为计算Hup A固定在芯片上的量，需要记录紫外处理前后基线变化，固定量=|（Hup A组紫外处理后基线均值-紫外处理前基线均值）|-|（Control组紫外处理后基线均值-紫外处理前基线均值）|；实验采用水溶性的反应体系，在紫外固定前需要检查Hup A是否有析出。
  7. 样品回收条件
    使用20~50 μg/mL纯的AChE作为验证对象，测试SPR样品回收的流程以及确定再生条件。按照下述分析方法流程，进样样品为20~50 μg/mL纯的AChE，其余的实验条件不变，进行方法、流程以及再生条件的验证。同时结合使用银染实验作为验证，以确保回收实验的有效性。
    注：需要确定蛋白的再生条件，以确保样品回收的有效性。固定的小分子一般优先考虑使用碱液进行再生。

二、利用Biacore T200样品回收系统进行小分子潜在靶标回收

  1. 方法设置
    1. 打开设置方法界面，点击General Setting，选择Detection中的Multi，在Buffer setting中填写A的名称HBS-EP，其它默认（图3.1）。


      图3.1 方法设置第一步：General Settings相关参数设置

    2. 点击Assay Steps中的New进行添加分析步骤，包括Startup（仪器预运行）、HT22 Total Lysate和PC12 Total Lysate三部分，分别选择对应的Purpose（图3），此时没有可选择的Connect to cycle type选项，需点击Cycle Types进行设置（图3.2）。
      注：HT22 Total Lysate和PC12 Total Lysate两个sample选择不同的Purpose，如Sample和Control of sample，便于在确定样品位置时区分离心管的位置，避免混淆。


      图3.2 方法设置第二步：Assay Steps设置

    3. 在Cycle Types界面选择New新建对应Startup、HT22 Total Lysate和PC12 Total Lysate三部分。选中Startup，在commands中选择sample，点击insert，然后设置具体的实验条件，将Sample solution设置为HBS-EP，其它默认（图3.3）。


      图3.3 方法设置第三步：Cycle Types设置

    4. 选中HT22 Total Lysate，在commands中选择Inject And Recover，点击insert，然后后选中进行具体的方法参数设置。Contact time设置为120 秒，流速设置为5 μL/min，Wash solution设置为HBS-EP，Recocery solution设置为50 mM NaOH，Incubation times设置为45秒，Deposition solution设置为150 mM Tris-HCl，pH6.0，Deposition solution volume设置为20 μL，Number of repetition设置为8其它默认。PC12 Total Lysate组别进行同样设置（图3.4）
      <em>注：样品结合时间，流速以及number of repetition（重复次数）需要调整好，结合这三个条件计算总体积需要在2~100 μL范围之内，否则会出现报错：“flow rate or contact time for command 'InjectAndRecover 1' must be changed because the total required injection volume is invalid. It must be in the range 2~100”；deposition体积至少设置为20 μL，体积过小会导致无法正常回收；deposition的溶液和recovery的溶液的pH最好能中和，使得两者混合之后的pH约为7.4。</em>


      图3.4 方法设置第四步：样品回收关键程序Inject And Recover设置

    5. 在Assay Steps界面，点击Startup，选中Connect to cycle type中的Startup，Number of replicates设置为5 times。HT22 Total Lysate和PC12 Total Lysate选中Connect to cycle type中的对应项目即可，其它默认不变（图3.5）。


      图3.5 方法设置第五步：Connect to cycle type设置

    6. 在Variable Settings界面，选中HT22 Total Lysate或PC12 Total Lysate，点击Define all values in method，设置样品使用的数量（图3.6）。


      图3.6 方法设置第六步：Variable Settings设置

    7. 方法设置完成后点击verification，检查方法是否可以运行，如果没有问题会出现提示：The method has been verified and can be used to set up a run（图3.7）。

      br /> 图3.7 方法设置第七步：verification方法可以正常运行

    8. 点击Setup Run进行下一步，flow path选择1,2,3,4即可，然后点击next浏览整个实验的进样顺序，确保其与我们设置的分析顺序一致（图4.1；图4.2）。


      图4.1 方法运行第一步：flow path的选择


      图4.2 方法运行第二步：确认样品进样顺序

    9. 点击next，选择Prime before run（图4.3）


      图4.3 方法运行第三步：选择Prime before run

    10. 点击next，设置样品以及回收样品空管的位置，一般可直接使用系统的默认设置（图4.4）


      图4.4 方法运行第四步：确认样品以及回收样品空管的位置并正确放置

    11. 将样品放在对应位置之后点击next，根据系统提示准备对应的缓冲液，确认无误后点击Start开始运行程序（图4.5）。


      图4.5 方法运行第五步：确认缓冲液的体积以及其余注意事项

  2. 总蛋白裂解液的回收
    1. 上机检测
      将HT22和PC12对应的蛋白裂解液样品（1.5~2 mg/mL）稀释5倍后进行检测，观察进样后的传感曲线变化，判断结合情况以及再生情况。
    2. 后续检测
      将回收得到的蛋白样品使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，使用PBS 进行溶解浓缩，最后结合WB、银染实验进行AChE检测。
  3. 数据分析与数据解析
    1. 判断样品与Hup A（或Control）结合的情况。随着样品进样响应值持续升高，在进样结束后缓慢解离，之后进行短暂的系统冲洗（wash）以及使用50 mM NaOH进行再生，将与Hup A结合的蛋白回收下来，整体的基线回归正常水平。
      注：在运行的过程中会突然有向下的峰出现，是由于在进行孵育，不影响整体实验，属于正常现象；再生完成后，整体水平可能会比基线低，由于碱性强，会再生掉芯片上的其它物质，不影响整体实验。
    2. NaOH再生之后基线回归正常水平，每个循环的变化相似，因此可以评估实验条件的合理性。
    3. 结合使用其它手段进行检测与分析，如WB、银染和质谱鉴定等实验，主要通过使用纯的AChE比较回收样品中条带出现的位置以及其它蛋白的情况，进行综合分析评价。

结果与数据分析

  1. 技术路线
    本实验利用紫外照射使得Hup A以及光敏芯片产生自由基，两者接触发生共价结合从而将Hup A固定在芯片上，使用5倍稀释后的细胞裂解液进行SPR回收富集，在缓冲液冲洗之后使用NaOH将结合的蛋白回收，对回收的蛋白使用冷冻干燥机进行干燥和浓缩，之后用于银染或酶解后进行质谱检测（图5）。


    图5 技术路线

  2. 验证模式细胞中AChE的表达
    通过资料调研发现PC12细胞[6]，HT22细胞[7]的AChE含量相对高，为了进一步确定研究对象，考察HT22细胞和PC12细胞中AChE的表达情况，通过WB实验，定量30 μg，使用AChE抗体检测两种细胞中的AChE。结果显示两种细胞中均含有AChE，但蛋白的表达量均不高，低于100 ng AChE水平。为了进一步考察HT22和PC12的总蛋白裂解液中AChE的位置，使用银染和考染进行定位（图6）。结果显示在63~75 kDa之间存在和纯AChE相同位置的条带，明确两种细胞系可以用于后续样品检测。


    图6 AChE在HT22细胞和PC12细胞中的验证（左：考染；中：银染；右：WB）

  3. Hup A的固定
    为了计算Hup A的固定量，将紫外处理前后的光敏芯片基线的变化与对照组进行扣减，计算得出Hup A的固定水平为186.13 RU（表1）。

    表1. Hup A的固定水平
    紫外处理前基线均值（RU) 紫外处理后基线均值（RU) │紫外前后差值│（RU） Hup A固定水平（RU）
    Hup A27471.9826889.52595.41186.13
    NC27834.3527425.06

  4. SPR样品回收程序验证
    为了证明SPR 样品回收程序以及后续检测流程的合理性，使用纯的AChE (low：20 μg/mL，high：50 μg/mL两种浓度) 进行验证。AChE的结合随着浓度增加而增强，再生之后基线回归，显示该循环的样品回收正常（图7）。在所有的循环回收结束之后对回收样品进行真空冷冻干燥、浓缩，再使用银染进行检测。银染结果显示纯的AChE两个浓度都能被回收，且回收的量与浓度相关（图8）。AChE测试结果表明程序设置正常且能够正常回收蛋白用于后续的检测，具有继续探索Hup A未知靶标的可行性。


    图7 高浓度和低浓度AChE回收传感图（合并）


    图8 AChE回收后银染鉴定结果图

  5. 细胞总蛋白裂解液的回收与验证
    使用HT22和PC12的总蛋白裂解液进行SPR 样品回收。总蛋白裂解液与紫外固定在光敏活性芯片的Hup A结合，进样结束后整体水平比基线高，且呈现出缓慢解离的状态，再生之后基线回归，显示蛋白裂解液的样品回收正常（图9）。
    为了检测总蛋白裂解液经过SPR样品回收和真空冷冻干燥浓缩之后是否含有AChE，使用WB和银染进行实验。结果显示WB未能在63~75 kDa检测出对应的AChE（约68 kDa）（图10，左），银染在相应位置存在较浅的条带（图10，右）。
    研究发现差异的原因可能是WB的检测灵敏度和银染灵敏度差异所导致[8–10]，但两者都可能达不到检测回收的蛋白中AChE的灵敏度，因此考虑使用灵敏度更高的质谱做进一步鉴定[11]。WB结果显示PC12蛋白裂解液中可能有类似于二聚体的存在，可能会影响检测结果，后续质谱只检测HT22的蛋白回收液。回收的样品质谱结果显示，鉴定到的蛋白中没有AChE，但是通过蛋白质量（Unique Peptides ≥ 2），丰度值（Hup A VS Ctrl Ratio ≥ 1.5）比较以及蛋白功能筛选，得到7个潜在的的备选靶标（Tubb5，Thbs1，Npm1，Jup，Fermt3，Atp5f1b，Alb）（表2）。备选靶标功能上主要与细胞骨架、细胞发育、分化、黏附、迁移、增殖、抑制程序性细胞死亡、线粒体ATP合成和核糖体功能等相关，与Hup A的神经保护、抗氧化作用、抗凋亡作用、促进细胞增殖、轴突生长的功能密切相关[12–15]，后续可以此为线索进一步确认上述蛋白是否为Hup A的直接靶标。


    图 9 HTT22和PC12的总蛋白裂解液回收传感图（合并）


    图10 总蛋白裂解液回收结果鉴定（左：WB；右：银染）

    表2 HT22细胞中Hup A潜在的作用靶标
    Accession Gene Symbol Unique Peptides HupA_VS_Ctrl_Ratio Mean_HupA Mean_Ctrl
    P07724Alb2121.261774667.114635.2
    P56480Atp5f1b31.841170437.0636616.2
    Q8K1B8Fermt331.774176365.72360138.4
    Q02257Jup54.821308024.0271284.8
    Q61937Npm121.854282350.82314211.0
    P35441Thbs123.30965955.4292346.6
    P99024Tubb5514.2668270592.34786716.9

失败经验

  1. 本次实验垂钓Hup A的靶标未能找到AChE，可能与没有加蛋白酶抑制剂导致AChE降解有关。
  2. 可能受限于AChE与Hup A的接触不充分，即空间位阻问题，导致AChE未与Hup A结合就被系统冲洗下来。
  3. 样品回收程序中分液的体积（deposition solution volume）需要估量，过少会无法回收到离心管里（1.5 mL离心管最少20 μL），导致实验失败。
  4. SPR回收程序回收到的样品每一管有30 μL左右，但是浓度低，为了提高后续实验检测的成功率，应尽可能多设置重复，以及将所有的回收样品浓缩成约30~50 μL体积再进行后续检测。

溶液配方

  1. 1× HBS-EP
    量取100 mL 10× HBS-EP（100 mM HEPES，150 mM NaCl，30 mM EDTA，0.5% v/v surfactant P20）加入900 mL MQ H2O配制1× HBS-EP溶液
  2. Pierce® IP Lysis Buffer
    25 mM Tris·HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol
  3. 1× PBS
    量取100 mL 10× PBS加入900 mL MQ H2O配制1× PBS溶液

致谢

感谢国家自然科学基金面上项目（82173798）的经费支持。感谢上海中医药大学交叉科学研究院王恺纯博士提供AChE活性检测方法、实验细胞以及技术上的支持。

参考文献

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