Cytoplasmic Injection of mRNA In Monkey Embryos

材料与试剂

1. 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）
2. 3.5 cm 操作皿（FALCON，catalog number: 353001）
3. Borosilicate Glass（B100-75-10）
4. Borosilicate Glass With Filament（BF100-78-10）
5. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
6. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
7. 移液枪及枪头（Eppendorf）
8. TH3 液（见溶液配方）
9. HECM9aa 培养液（见溶液配方）
   

仪器设备

1. 培养箱（Thermo Scientific， model：Forma 3111、Forma 371）
2. 拉针仪（Sutter Instrument, model：P97）
3. 断针仪（Narishige, model：MF-900）
4. 倒置显微镜（Olympus, model：IX-73）
5. 体视显微镜（Olympus， model：SZX7）
6. IM300 Microinjector（Narishige）
7. 一对显微操作臂（Narishige）
8. 微量注射器（Narishige IM-9B）
   

实验步骤

实验流程

1. 超排母猴及获取卵母细胞；
2. 单精注射获取受精卵；
3. 进行胚胎胞质内RNA注射，完成注射后，将胚胎移入培养碟中放置培养箱培养；
4. 根据培养发育情况，将胚胎移植入受体体内；
5. 做好详细记录。

mRNA注射

1. 将TH3显微注射皿做好预热：取200 μl TH3液，在微操作碟内制备10-13 TH3 液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
2. 将HECM9aa 培养皿做好预热：取 200 μl HECM9aa培养液，在培养皿内制备10-13个液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
3. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为100-110 μm和内径为15-20 μm，打弯成20-30度的持卵针；
4. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（BF100-78-10）拉制成需要的注射针，在断针仪上打弯20-30度；
5. 将制作好的注射针倒扣在待注射的sgRNA中，以虹吸法吸入；
6. 将制备的显微注射皿放置于载物台上，从低倍视野开始观察整个显微操作滴；
7. 将持卵针安装于操作仪左侧的IM9B上，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平；
8. 将注射针安装于操作仪右侧的IM300上，调整注射压力为30 psi、平衡压力0.1-0.3psi,缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平，保持与持卵针在同一水平线；
9. 单精注射完成后胚胎培养六个小时以上，在显微镜下检查原核形成情况，出现两个原核的胚胎视为正常受精；
10. 用胚胎转移管将一组受精卵转移到操作皿中，操作尽可能在20-30 min内完成；
11. 高倍镜下观察合子状态，确信观察到双原核而且形态良好；
12. 用左侧持卵针抓取并固定合子后，推动右侧注射针透过透明带，进入卵胞质中，进行注射。观察注射针尖端是否通畅，若不通畅，将注射针在持卵针上轻轻碰击以增大注射针尖的直径，调整合适的注射压力；
13. 完成注射后，将注射针从合子中迅速撤出，持卵针放开合子；
14. 所有合子注射完毕后，应当立即移回HECM9aa培养液，置于37 °C，5% CO₂ 培养箱培养，等待胚胎移植。

溶液配方

1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表1）
   
   表1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
   

   成分	/100ml	/50ml	备注
   NaCl	3.329 ml	1.665 ml	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	119.5 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	147 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	51 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	24 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	105.3 mg
   HEPES	240 mg	120 mg
   D-Glucose	90 mg	45 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	6 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	85 μl
   BSA	300 mg	150 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	500 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	5 μl
   pH	7.4

   
   
2. HECM-9（表2）
   
   表2. HECM-9 配制表
   

   成分			/100ml		终浓度
   NaCl			0.6639 g		113.6 mmol/L
   KCl			0.0224 g		3 mmol/L
   CaCl2·2H2O			0.0279 g		1.9 mmol/L
   MgCl2·6H2O			0.0102 g		0.5 mmol/L
   NaHCO3			0.2100 g		25 mmol/L
   Sodium lactate (60% syrup)			0.0504 g		4.5 mmol/L
   PVA			0.01 g		0.1 mg/ml
   1 mol/L HCl			0.14 ml		1.4 mmol/ml
   11 AA with Pantothenate			1 ml
   100X AA stock
   成分	MW	100X 母液浓度		终浓度
   Taurine	125	50 mmol/L		0.5 mmol/L
   Asparagine	132	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Cysteine	121	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Histidine	155	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Lysine	146	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Proline	115	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Serine	105	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Aspartic acid	133	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glycine	75	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamic acid	147	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamine	146	20 mmol/L		0.2 mmol/L
   Pantothenate	238	0.3 mmol/L		3 μmol/L