Intracytoplasmic Sperm Injection of Monkeys

材料与试剂

1. 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）
2. 3.5 cm 操作皿（FALCON，catalog number: 353001）
3. Borosilicate Glass（B100-75-10）
4. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
5. 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
6. 移液枪 （Eppendorf）
7. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
8. 一次性使用无菌注射器带针（KDL 1ml）
9. PVP（Sigma，catalog number：PVP360）
10. 水银
11. TH3液（见溶液配方）
12. T3液（见溶液配方）
13. HECM9aa培养液（见溶液配方）
14. NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）
15. KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）
16. CaCl₂·2H₂O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）
17. MgCl₂·6H₂O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670）
18. NaH₂PO₄（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）
19. NaHCO₃（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）
20. HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）
21. D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）
22. Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）
23. Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）
24. BSA（absin，catalog number：abs9156）
25. penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）
26. PVA（Sigma-Aldrich，catalog number：P8136）
27. HCl（沪试，catalog number：7647-01-0）
28. Taurine（Sigma-Aldrich，catalog number：T8691）
29. Asparagine（Sigma-Aldrich，catalog number：A4159）
30. Cysteine（Sigma-Aldrich，catalog number：C7352）
31. Histidine（Sigma-Aldrich，catalog number：H6034）
32. Lysine（Sigma-Aldrich，catalog number：L5501）
33. Proline（Sigma-Aldrich，catalog number：L5607）
34. Serine（Sigma-Aldrich，catalog number：S4311）
35. Aspartic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：A8949）
36. Glycine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8790）
37. Glutamic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：G8415）
38. Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）
39. Pantothenate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5155）
40. Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）
    

仪器设备

1. 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
2. 拉针仪（Sutter Instrument，model：P97）
3. 断针仪（Narishige，model：MF-900）
4. 倒置显微镜（Olympus，model：IX-73）
5. 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）
6. 一对显微操作臂（Narishige）
7. 微量注射器（Narishige IM-9B）
8. 离心机（Eppendorf centrifuge，model：5702）
9. 压电冲击驱动系统（Prime Tech）
   

实验步骤

实验流程

1. 超排母猴及获取卵母细胞；
2. 猴子精子的采集与获能处理；
3. 完成注射，将卵子移入培养碟中放置培养箱培养；
4. 做好详细记录。

单精注射步骤
一、精子获能处理

1. 将采集的精子液化15-20 min，取液化好的精子上清加入到15 ml离心管内；
2. 在精子离心管内加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
3. 离心完后去上清，再加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
4. 离心完后去上清，再加入4 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
5. 离心完后去上清，再加入2 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
6. 离心完后等待精子上游，上游3分钟；
7. 上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。
   
   
   

二、单精子显微注射

1. 将TH3显微注射操作皿做好预热：取200 μl TH3液，在显微操作碟内制备4-5滴TH3液滴和一个柱状TH3液滴，再做一个10% PVP的液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油；
2. 将HECM9aa培养皿做好预热：取200 μl HECM9aa培养液，在培养皿内制备10-13个液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
3. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为100-110 μm和内径为15-20 μm，打弯成20-30度的持卵针；
4. 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为7-8 μm和内径为5-6 μm，打弯成20-30度的精子注射针；
5. 用1 ml注射器从注射针的末端装入1-2 mm水银待用；
6. 将制备的显微注射皿放置于载物台上，从低倍视野开始观察整个显微操作滴；
7. 将持卵针安装于操作仪左侧的IM9B，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平；
8. 将注射针安装于操作仪右侧的piezo压电冲击驱动系统的微注射器上，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平，保持与持卵针在同一水平线；
9. 用胚胎转移管将一组MII期卵母细胞转移到操作皿TH3液滴中，同时将处理的3-5 μl获能精子加到另一个TH3液滴内；
10. 镜下在10% PVP内清洗注射针并调整注射针到精子滴中，用注射针尖轻击精子尾部来制动精子后，将精子尾先头后吸入注射针内，移动注射针到放置卵母细胞的注射滴中（当注射针内的精子用完后，重复此步骤）；
11. 用持卵针抓取并固定MII期卵母细胞，并调整第一极体在六点或十二点的方向，注射针利用脉冲震荡刺穿破透明带，将精子推到注射针口后通过脉冲震荡辅助注射入卵母细胞内，以尽量少的液体吐出精子；（见图1、图2）
    
    
    图1. 极体在约 6 点方向，脉冲震荡刺穿破透明带
    
    
    图2. 精子推到注射针口，准备进行注射
    
    
12. 完成注射后，持卵针放开卵母细胞；
13. 重复上述操作直至完成所有的MII期卵母细胞的精子注射，将胚胎转移到HECM9aa培养液中在 37 °C，5% CO2培养箱中培养；
14. 培养箱中培养六个小时以上，在显微镜下检查原核形成情况，出现两个原核的胚胎视为正常受精。（见图3）

溶液配方

1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表2）
   
   表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
   

   成分	/100ml	/50ml	备注
   NaCl	3.329 ml	1.665 ml	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	119.5 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	147 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	51 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	24 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	105.3 mg
   HEPES	240 mg	120 mg
   D-Glucose	90 mg	45 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	6 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	85 μl
   BSA	300 mg	150 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	500 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	5 μl
   pH	7.4

   
   
2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表3）
   
   表3. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表
   

   成分	/100ml	/10ml	备注
   NaCl	3.329 ml	333 μl	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	23.9 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	29.4 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	10.2 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	4.8 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	21.06 mg
   Glcose	90 mg	9 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	1.2 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	17 μl
   BSA	300 mg	30 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	100 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	1 μl
   pH	7.4

   
   
3.  HECM-9（表4）
   
   表4. HECM-9 配制表
   

   成分		/100ml	终浓度
   NaCl		0.6639 g	113.6 mmol/L
   KCl		0.0224 g	3 mmol/L
   CaCl2·2H2O		0.0279 g	1.9 mmol/L
   MgCl2·6H2O		0.0102 g	0.5 mmol/L
   NaHCO3		0.2100 g	25 mmol/L
   Sodium lactate (60% syrup)		0.0504 g	4.5 mmol/L
   PVA		0.01 g	0.1 mg/ml
   1 mol/L HCl		0.14 ml	1.4 mmol/ml
   11 AA with Pantothenate		1 ml
   100X AA stock
   成分	MW	100X 母液浓度		终浓度
   Taurine	125	50 mmol/L		0.5 mmol/L
   Asparagine	132	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Cysteine	121	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Histidine	155	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Lysine	146	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Proline	115	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Serine	105	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Aspartic acid	133	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glycine	75	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamic acid	147	1 mmol/L		0.01 mmol/L
   Glutamine	146	20 mmol/L		0.2 mmol/L
   Pantothenate	238	0.3 mmol/L		3 μmol/L