材料与试剂
药品
- FSH(图1和2)、LH、PG(供体、受体同期发情处理)PMSG、孕酮

图1. 超排用FSH商品1

图2. 超排用FSH商品2
- PBS(或冲卵液,图3)、培养液、HOLDING 液(图4)

图3. 冲卵液

图4. 胚胎操作液
- 胚胎冷冻液(图5)

图5. 胚胎冷冻液
- 牛血清白蛋白(或者灭活羊血清)
- CIDR(图6)、孕酮海绵栓(图7)

图6. 羊用阴道栓(CIDR)

图7. 孕酮海绵栓
- 无水酒精、2%碘酊
- 新洁尔灭、生理盐水
- 青霉素(80万单位/支)、 链霉素(80万单位/支)
- 蒸馏水、五蒸水
- 肥皂
- 麻醉药/解药, 2%静松灵
- 维生素A/D/E
器材
- 手术台剃须刀及刀片、、剪毛剪、直剪、手术刀柄、手术刀片(21#)、止血钳、巾帕钳、持针器、镊子、肠钳(带孔胶管)、缝合针(半弯12×65、3/8圆12×48)缝合线、解剖盘(大、小)缝合器(图8)

图8. 缝合器
- 羊用阴道栓放置枪(图9)

图9. 羊用阴道栓放置枪
- 采卵管、套针、移植器、胚胎吸管或者微量进样器、吸头
- 脱脂棉、脱脂纱布、胶布、创布、止血纱布、面巾纸、毛巾
- 头皮针(8#或9#、尖端磨钝)或曲别针
- 乳胶管16#—20#针头、Φ8 mm玻璃管
- 一次性注射器:1 ml、5 ml、20 ml
- Φ120 mm表面皿、疫苗瓶盖、沙片、细菌滤器(0.25 μ)、微量取液器、
- 广口瓶、烧杯(1000 ml,100 ml)、玻璃棒
- 喷壶(喷消毒液用)
- 棕色和白色广口瓶
- 直径90 mm培养皿, 四孔培养皿, Φ35 mm培养皿
- 冲胚、移植记录表格
仪器设备
- 恒温台
- 显微镜
- 恒温水浴锅
- 烘箱
- 高压灭菌器
- 腹腔镜(图10)

图10. 腹腔镜冲胚和移植
- 胚胎冷冻程序降温仪(图11)

图11. 胚胎冷冻程序降温仪
实验步骤
一、供受体羊的选择
- 供体羊选择品种优良,生产性能好。
遗传性稳定,谱系清楚,符合该品种的一切特性。体质健壮,繁殖机能正常,性欲旺盛,无遗传病、传染性疾病和生殖道疾病。年龄在2.5-6岁为宜 (也有早期超排的),产羔60天以上。与之交配的种公羊要求:谱系清楚,检疫合格,遗传性稳定,生产性能优良,符合本品种特征,精液品质良好。 - 受体羊选择体质健康,拥有正常的发情周期,无繁殖机能疾病,经检疫无传染病,膘情七成以上。处于最佳繁殖年龄 (2-5岁),经产羊应在分娩后90天以上,产羔性能和哺乳性能良好,无流产史。经观察至少有两个以上正常发情周期的母羊,屡配不孕者不能做受体。
二、胚胎移植前的营养调节等准备工作
- 一般认为,供受体羊的营养状况对胚胎移植的成功率影响较大,种母羊和受体羊应加强营养并且应适当给予运动,供体羊在体重增加时,超排效果好一些,受体羊在增重阶段移植胚胎受胎率高一些。
- 移植前6-8周左右,开始给供受体羊适当补饲精料,种母羊、受体羊精料喂量应0.2至0.5千克,干草应自由采食并给予充足饮水。同时,如果起步营养状况差的话,可考虑每只受体羊肌注一定量的亚硒酸钠、VE和VA.D,补充微量元素和维生素。保证一定的日增重。
- 每日应对种母羊和受体羊只进行不少于2小时的自由运动或强制性运动但要禁止粗暴驱赶羊只。
- 在放栓之前注射疫苗或驱虫药,进入超排程序后禁止注射疫苗。(询问当地兽医)
- 所有供、受体羊都应打上耳号并尽快开始记录发情情况。所有羊应立即公母分群、断奶,并做好记录。
- 羊群大小适中,统一编制和打耳号,耳号应清楚易见。
- 羊舍清洁、通风、干燥、温度适宜、环境稳定无应激反应。
三、超数排卵与同期发情
表1. 羊鲜胚生产和移植程序
顺序 | 供体操作 | 受体操排 | 备注 |
第1天 | 放CIDR或自然发情 | 放海棉栓 | |
第11天上午 | 2 ml FSH | | FSH的注射时间为7:00和19:00;肌肉注射,左右臀部各一次 |
第11天下午 | 2 ml FSH | | |
第12天上午 | 1.5 ml FSH | | |
第12天下午 | 1.5 ml FSH | | |
第13天上午 | 0.5 ml FSH | | |
第13天下午 | 0.5 ml FSH 取出 CIDR | 取出海棉栓 | |
第14天上午 | 发情后配种或AI,AI剂量是普通输精量的2-3倍 | 试情 | 发情时间以母羊稳定接受跨的时间为准,精确到小时 |
第14天下午 | 配种或AI 共3次,间隔12小时 | 试情 | |
第21天 | 冲胚 | 移植 | |
说明: - 严格按以上时间执行,并保证操作是卫生、无菌;
- 取出的CIDR用洗洁精水冲洗干净,晾干后装入塑料袋备用(可重复用2次);
- 供受体放入CIDR和海绵栓后,注意观察,发现有掉落应及时补上。
- 个别羊放栓后有阴道感染流脓现象,取出阴栓,用青连霉素冲洗后再放入干净的栓。
- 抽取海棉栓时,应小心慢取,不应遗留任何碎片于阴道。
- FSH剂量还因考虑季节、日照、营养、供体羊的年龄等。
如果供体是自然发情,程序如下:
日期 | 供体处理 | 备注 |
0 | 发情 | |
15 | 上下午注射FSH | |
16 | 上下午注射FSH | |
17 | 上下午注射FSH,上午1.6 ml PG | |
18 | 上下午注射FSH | |
其它操作和剂量同上
四、配种与人工授精
- 种公羊前期应补充精料饲养,并进行采精和配种调教。
- 种公羊与种母羊合理的比例以1:3-4为宜;受体羊的准备应为超排种母羊数量的12倍,即种母羊:受体羊为1:12。如果是AI,建议至少第一次是本交 (在发情开始后12小时)。
五、受体准备和试情 - 市场上买回的受体羊必须是空怀的,如果不能确认是否怀孕,应尽块注射氯前列烯醇 (或前列腺素,或叫PG)。用量为:经产羊1.0毫升,初产羊0.8毫升。注射后24小时起,观察流产情况;记录流产羊号,胎儿大小等情况。连续观察3天。
- 试情公羊带试情布或结扎放进羊群试情,观察记录稳定接受爬跨的母羊号码,也可用公羊身上带染料的方法自动标记发情母羊,应特别注意发情日刚天亮的那段时间。
六、取卵、检胚与分级 - 羊胚胎的采集:试情和配种,手术前 24 h 饥饿不断水处理,手术取卵前,对手术区域进行剃毛清洁。手术前做好麻醉和保定工作,注意手术者和手术部位的消毒,观察并记录卵巢状况和排卵点数。
- 输卵管采集胚胎:收集的胚胎是 2-8 细胞期胚胎,冲胚的部位是输卵管喇叭口,输卵管中一头插入大小合适的塑料管,另一头用导管针冲洗,每侧冲液10-20 ml。
- 子宫中收集的胚胎为桑椹胚和囊胚。
- 胚胎的判断和分级如表2,主要评价依据是细胞团机构关系和应该到达的发育阶段。
表2. 胚胎的判断和分级
1级胚胎 | 胚胎形态完整,处于正常的发育阶段,外形匀称,胚胎呈球形;分裂球细胞大小均匀,结构紧凑,透明度适中,没有或只有少量游离细胞。 |
2级胚胎 | 发育稍迟缓,有少量游离细胞 (少于20%),细胞团完整,胚胎仍呈球形,细胞之间结合紧密。 |
3级胚胎 | 发育迟缓1-2天,卵裂球大小不均匀,透明度变化明显 (太暗或太明),胚胎游离细胞较多 (大于20%,小于50%),细胞联结不够紧密,但胚胎仍呈球形,有明显的细胞团结构。 |
4级胚胎 | 发育迟缓 (2天以上);细胞团破碎;细胞死亡退化。 |
七、胚胎移植
羊胚胎移植受体与供体羊进行同期发情处理。
- 手术前对羊进行24 h饥饿和10 h断水处理,以便于手术。收集的羊胚胎经holding液洗5-6遍,等待移植。胚胎移植部位分为输卵管移植和子宫角移植,即 2-8 细胞期的胚胎选择输卵管移植,桑椹胚和囊胚选择子宫角移植。
- 受体羊固定,手术部位消毒、麻醉和镇痛,腹腔镜辅助(图10)或直接用手术取出子宫或子宫角,用大小合适的针头扎孔后,用连接1 ml注射器的胚胎移植器注入胚胎(图11)。胚胎装管待用的吸入方式为:大量液体,气泡,含胚胎液,气泡和液体的“五段方式”。

图11. 羊子宫角胚胎移植
- 移植后伤口缝合消毒,受体羊注射苏醒和镇痛剂,同时注射一定量的抗菌素三天。需要的话注射孕酮保胎。
- 注意观察和记录受体羊群发情情况,需要时可以超声波孕检一次。
八、影响胚胎移植技术成功率因素 - 供受体羊的营养健康状况和羊场管理水平
- 胚胎质量和胚胎退化问题
- 无菌操作和移植水平
- 受体羊术后管理
- 国产激素与进口激素
- 操作室温度、湿度和洁净度

图12. 绵羊胚胎(day 6, 晚桑)
图13. 山羊胚胎(day7,扩张囊胚)
九、精液和胚胎的冷冻解冻,胚胎实验操作 - 精子冻存
采精操作步骤 : - 胚胎冻存
目前大体有两种胚胎冷冻保存的方法,即程序化冷冻法和玻璃化冷冻法。 - 体外授精
羊卵母细胞的体外授精
配制 percoll梯度分层液分离精液 (用M199配置90%和45%的percoll梯度分层液),3000 rpm 离心15 min,收集活精子。在洗涤精子的同时,将每滴15~20个成熟卵母细胞放人90 μl受精液中,加入洗涤后的精子,精子浓度为 1×107个/ml,放入CO2培养箱中培养。培养条件为38. 5 °C、5% CO2及饱和湿度培养箱中培养。 - 受精卵注射
- 体细胞克隆羊