Transcervical Embryo Transfer in Mice

研究背景

小鼠是发育生物学和生殖生物学领域重要的模型动物，其胚胎移植技术是研究体外受精、嵌合体、转基因、基因打靶、胚胎冷冻种子库以及品系净化的关键环节。小鼠胚胎移植技术包括手术法和非手术法，但手术法不仅费时、技术要求高、增加小鼠疼痛，且术后易感染，而非手术法简单易行，节约时间，对小鼠损伤小，不易感染，减少小鼠的痛苦，同时也符合实验动物福利伦理原则。早在1951年，Beatty等人首先报道小鼠的非手术法胚胎移植，随后Marsk、王培生等人也都相继研究改进了非手术法胚胎移植，但成功率始终较低，这严重限制了该项技术的推广与应用。本文采用全新的小鼠非手术胚胎移植器，将小鼠桑椹胚或囊胚经子宫颈移植单侧子宫角，显著提高移植成功率。

材料与试剂

1. 小鼠饲养笼
2. 婴儿棉签
3. 眼科剪刀
4. 磁条
5. 小鼠非手术胚胎移植器（TCET）（保定正木生物科技有限公司）（图1）
   
   
   图 1. 小鼠非手术胚胎移植器（TCET）
   
   
6. 开膣管（保定正木生物科技有限公司）
7. 吸胚管（保定正木生物科技有限公司）
   
   
   图 2. 吸胚管
   
   
8. 一次性90 mm细菌培养皿（青岛金典生化器材有限公司）
9. 一次性1 mL注射器（江西洪达医疗器械集团有限公司）
10. CD-1成年雌鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）
11. CD-1结扎公鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）
12.  桑椹胚或囊胚
13. DPBS磷酸盐缓冲液（见溶液配方）
14. 阿佛丁（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 体视显微镜（Nikon SMZ 745）
2. 恒温热台（北京比威克生物技术有限责任公司）
3. 纤维冷光源（南京博城光电科技有限公司 LED-100）
   

实验步骤

1. 挑选外阴部肿胀的发情期雌鼠，与结扎公鼠1:1在下午17:00合笼，次日上午8:00检查阴道栓，见栓者记为假孕0.5 d，2天后即假孕2.5 d雌鼠作为胚胎移植受体。
2. 在90 mm培养皿做若干100 μL的含0.4%牛血清白蛋白的DPBS液滴，将胚胎洗涤干净后依据受体数量将胚胎分组，每只受体可移植5-15枚胚胎，利用吸胚管将每组胚胎紧密聚集在一起。
3. 左手抓住TCET密封管，右手抓住TCET手柄，体视显微镜调至最低倍，首先用TCET吸取7 mm DPBS液和2 mm气泡，再吸取胚胎，含胚胎的液体段长度控制在5 mm以内，最后再吸取3 mm气泡。在吸取胚胎的时候，尽可能让TCET前端直立吸取胚胎。(图3, 4)。
   
   
   图 3 体视镜下利用TCET装载胚胎
   
   
   图 4 四段法装载胚胎的TCET模式图
   
   
4. 在纤维冷光源侧面吸附一条宽10 mm长100 mm的磁铁，将装好胚胎的TCET手柄直立吸附在磁铁上，静置2 min以上（图5）。
   
   
   图 5 利用磁条直立固定装载胚胎的TCET
   
   
5. 假孕2.5 d受体小鼠腹腔注射阿佛丁麻醉（每10 g体重注射0.2 mL），利用左手拇指和中指固定小鼠尾根，右手持开膣管蘸取少量DPBS液后缓慢插入小鼠阴道，在纤维冷光源下确认子宫颈口并用婴儿棉签擦拭，清洁子宫颈口（图6）。
   
   
   图 6 腹腔注射阿佛丁麻醉受体小鼠
   
   
6. 右手持装有胚胎的TCET，将TCET前端在DPBS液中浸润后经子宫颈口缓慢插入任意一侧子宫角，通常TCET能够轻松流畅地进入子宫内。如果感觉有任何阻力，立即停止。极个别小鼠的子宫颈口可能很紧，可用一个未装胚胎的TCET提前疏通一下子宫颈口，疏通深度不要超过5 mm（图7，图8，图9）。
   
   
   图7 利用开膣管打开小鼠阴道，定位子宫颈口
   
   
   图 8 将装载胚胎的TCET完全插入小鼠一侧子宫
   
   
   图9 按压TCET手柄，将胚胎注入子宫内
   
   
7. TCET中间密封管身约进入开膣器一半时，左手拇指和食指固定TCET和开膣管，右手捏住TCET手柄向下缓慢按压8 mm，然后，左手将TCET手柄和小鼠尾巴固定在一起，右手捏住TCET密封管和开膣管一起向上运动至TCET手柄，随后一起拔出TCET和开膣管。如有需要，可用剪刀在左耳或右耳剪缺口标记（视频1）。
   
   
   
   视频1. 开膣管的使用
   
   
8. 将小鼠置37℃恒温热台直至苏醒。
   
   
   
   视频2. 小鼠非手术胚胎移植
   
   

注意事项

1. 胚胎移植之前，最好先用几只成年雌鼠模拟练习TCET的操作方法。
2. 受体小鼠必须麻醉，否则妊娠率和产仔率会显著下降。
3. 推荐使用8周龄以上，体重26 g以上的假孕2.5 d的CD-1成年雌鼠作为胚胎移植受体。
4. 所移植胚胎的发育阶段必须是致密桑椹胚或囊胚，且胚胎仅能被移植至单侧子宫角。
5. TCET移植器为一次性使用，如果反复使用，产仔率会有所降低。
6. TCET移植器必须缓慢插入子宫颈，最好一次完成，如遇阻力，立即停止，不可反复插入。
   

溶液配制

1. DPBS液：
   称取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na₂HPO₄ 1.15 g、KH₂PO₄ 0.2 g，加入500 mL超纯水，震荡溶解；再称取CaCl₂ 0.1 g和MgCl₂·6H₂O 0.1 g，加入500 mL超纯水，震荡溶解，将以上两种溶液混合均匀后，加入2 g牛血清白蛋白，静置30 min，0.22 μm滤器过滤除菌，分装，冷藏保存。
2. 阿佛丁：
   称取2.5 g 三溴乙醇（Sigma T48402）置200 mL烧杯，加入5 ml 叔戊醇（成都艾科达化学试剂有限公司）溶解，再加入195 mL生理盐水，60 °C磁力搅拌溶解，完全溶解后室温冷却，0.22μm过滤除菌，避光冷藏保存。
   

参考文献

1. Bin Ali, R., van der Ahe, F., Braumuller, T. M., Pritchard, C., Krimpenfort, P., Berns, A. and Huijbers, I. J. (2014). Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Res 23(4): 691-695.
2. Cui, L., Zhang, Z., Sun, F., Duan, X., Wang, M., Di, K. and Li, X. (2014). Transcervical embryo transfer in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci 53(3): 228-231.
3. Green, M., Bass, S. and Spear, B. (2009). A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques 47(5): 919-924.
4. Steele, K. H., Hester, J. M., Stone, B. J., Carrico, K. M., Spear, B. T. and Fath-Goodin, A. (2013). Nonsurgical embryo transfer device compared with surgery for embryo transfer in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci 52(1): 17-21.
5. Stone, B. J., Steele, K. H., Men, H., Srodulski, S. J., Bryda, E. C. and Fath-Goodin, A. (2020). A Nonsurgical Embryo Transfer Technique for Fresh and Cultured Blastocysts in Rats. J Am Assoc Lab Anim Sci 59(5): 488-495.
6. Stone, B. J. (2020). Nonsurgical Embryo Transfer Protocol for Use with the NSET Device. Methods Mol Biol 2066: 107-111.