In Vitro Fertilization of Chicken Oocytes

材料与试剂

1. 试验鸡
   来自江苏省家禽研究所试验场10~12月龄产蛋高峰期的SR96黄羽母鸡和狼山黑羽母鸡。
2. 硫贲妥钠麻醉(上海新亚药业有限公司，批号：9902102)
3. 青霉素（Sigma, catalog number: P3032）
4. 链霉素（Sigma, catalog number: P4333）
5. 冰醋酸
6. 醋酸钠
7. NaHCO₃
8. 磷酸氢二钾
9. 葡萄糖
10. 蔗糖
11. NaCl
12. KCl
13. CaCl₂
14. NaHCO₃
15. C-2精子稀释液成份（见溶液配方）
16. 改良的 Ringer’s液配方（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 孵化箱（无锡设备厂，型号：鸣凤4820型）
2. 培养箱（南京实验仪器厂，型号：HG303-4K型）
   

实验步骤

1. 精液采集
   采取7~14月龄的隐性白羽公鸡的精液。使用血细胞计数板计数，在400倍镜下观察，整个视野中布满精子，精子间几乎无缝隙，则精子密度判定为“密”，精液密度为“密”(25.6 ± 1.2)×108/ml，活力为0.9。（依据精子活力评定方法，即400倍镜视野中有90%以上的精子做直线前进运动，则精子活力评定为0.9）精液用含有硫酸链霉素1 g/L和青霉素5,000 IU/L的C-2精子稀释液1:1稀释（详见溶液配方部分）。孵育在38.5 °C培养箱中，30分钟之内使用 (Tanaka et al., 1994)。
2. 确定取卵时间
   本试验采用产蛋高峰期母鸡，均在人工补光（夜间开灯）和自然采光相结合的条件下饲养。选择产蛋周期长的母鸡，在母鸡产蛋后的不同时间段即30~40 min、50~60 min、90 min以上等三个时间段内收集卵黄卵，确定适宜的取卵时间段 (Petters R, 1992)。
3. 实验分组与处理
   1. 阴性对照组：20只母鸡，从产蛋后30~40 min未受精鸡的喇叭口或漏斗部收集未受精的卵子，按IVF方法步骤体外操作后移回母鸡输卵管内，这一组用来测定未受精蛋孤雌生殖的程度。
   2. 试验1组:
      1)

      体外受精-体内发育试验
      母鸡在产蛋后15 min（上午6：00~7：00）或20 min（上午8：00~9：30）用硫贲妥钠麻醉（2.5-4.5 mg/kg，约5~10 min）；
      2)

      在躯体左侧倒数第一和第二根肋骨之间开4~6 cm长的切口，用装有PBS的巴氏吸管冲洗卵巢囊回收卵子，将卵子用金属勺取出。每个卵子单独收集放置于含有PBS的培养皿中，一切操作均在无菌环境中进行；
      3)

      收集的卵子利用含有60~70 ml改良的Ringers液中（详见溶液配方部分）清洗两遍，并置于60~70 ml新鲜Ringers液中；
      4)

      分别取0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml稀释后的精液滴加在胚珠上，并在41 °C的条件下培养15~20 min，使其体外受精；
      5)

      利用60~70 ml的Ringers溶液清洗受精卵两遍以除去多余的精子，并单个置于盛有新鲜Ringers液的烧杯中，待移；
      6)

      受精卵移植用上述同样的手术方法，将母鸡输卵管喇叭口拉出，撑开，清洗过的受精卵从烧杯灌入张开的喇叭口，轻轻摇动输卵管喇叭口，使受精卵移向输卵管膨大部移动，轻轻放回卵巢囊中，缝合切口。
      注：不要在输卵管内部留有空气，并缩短手术时间以避免对母鸡的刺激。整个手术在无菌条件下进行。在卵移植入输卵管的第二天，收集的蛋完整且为硬壳者，放入孵化箱中标准条件下孵化。
      
   3. 试验2组:
      将体外受精体外发育试验10枚卵用于体外培养试验，母鸡产蛋后30~40 min内手术法取卵，体外受精的步骤同试验1，卵子体外受精15 min后，弃去Ringers液，添加新鲜蛋白，其量足够覆盖卵(40 ml)，随后用保鲜膜盖在烧杯上封口，然后在温度为38.3 °C左右，湿度为50%~60%条件下孵化24 h，观察卵是否受精发育。

结果与分析

1. 取卵时间的确定
   从表1可以看出：母鸡在产蛋后的30~40 min内开刀，排出的卵子72%(36/50)在卵巢囊中，此时收集卵比较适宜。产蛋后50~60 min取卵，60%(18/30)已进入输卵管，仅40%(12/30)在卵巢囊中。90 min后，排出的卵基本上均在子宫中或泄殖腔中，此时收集卵不合适（图1和2）。然而，在试验过程中，我们注意到如果母鸡产蛋时间是在上午7：00或7：30之前，则排下一个卵的时间间隔较短，大多数在产蛋后的30 min或40 min内排卵，此时开刀可以获得适时的卵。如果母鸡在上午7：30以后产蛋则排卵时间间隔较长一些，大多数在产蛋后40 min~50 min内排卵。9：30以后产蛋的母鸡，排卵时间跨度较大，确定较适宜的取卵时间比较困难。
   
   
   图1卵子收集手术操作过程
   
   
   图2 卵子收集手术操作过程示意图
   （1）将鸡保定并且麻醉，在躯体左侧倒数第一和第二根肋骨之间，沿肋骨平行方向切开4—6cm的切口；（2） 用金属钩，将切口处拉开使其切口撑开；（3）用装有PBS的巴氏吸管冲洗卵巢囊回收卵子；（4）将卵子用金属勺取出；（5）缝合切口。
   
   表1. 不同取卵时间的情况
   

   取卵时间	产蛋后30~40 min	产蛋后50~60 min	产蛋后90 min以上
   试验鸡(只)	50	30	10
   排卵情况	卵巢囊内或(未排)	卵巢囊内或(子宫内)	子宫内或(泄殖腔内)
   排卵数(枚)	36(14)	12(18)	10(0)

   
   
2. 体外受精-体内发育试验结果
   试验1组中4组不同精液给量的体外受精和胚胎发育结果如表2所示。从表2中可以看出：总计44只体外受精母鸡中，于移植第二天产下28枚蛋，其中硬壳蛋21枚，软壳蛋7枚。证明鸡卵可在体外受精，移回体内能正常发育受体母鸡成功产下受精种蛋（表2）。在用不同精液量(0.1~1.0 ml)的4个组之间，硬壳蛋的产生率差异不显著(P>0.05)。而受精率在0.1 ml与0.2 ml 、 0.5 ml 、 1.0 ml 组之间差异显著(P<0.05)，0.5 ml 和1.0 ml 组之间差异不显著(P>0.05)。分析结果中不难看出：0.1 ml 精液给量组在体外受精时较适宜，在不浪费精液的情况下，即可达到受精目的。虽然每一个组里都有受精蛋，然而，只有在0.1 ml 和0.5 ml 精液的两个组中，3枚受精蛋孵出了小鸡(10.71%)（图3），它们出壳后均健康，在0.2 ml 组中2枚受精蛋在孵化过程中发育1d后死亡，在1.0 ml 组中1枚发育到第11d时死亡，在此试验中，20只未受精卵，移植后产下6枚蛋，孵化后未见有发育的鸡胚,证明没有孤雌生殖。在表2结果中还显示：卵子在15~20 min可受精,。在此试验中，阴性对照组的结果显示，母鸡未受精卵移植后，未见有受精蛋产出。孵化后未见有发育的鸡胚，证明无孤雌生殖 (Howarth B. Jr., 1970)。
   
   
   
   图3. 体外受精后的鸡胚发育
   
   表 2. 不同精液量对受精率、胚胎发育率和出雏率的影响
   

   精液量	移植卵数(枚)	产蛋数(个)	受精率(%)	胚胎发育率(%)	出雏率(%)
   0.1	15	10(4)	30.00(3/10) *	20.00(2/10)	10.00(1/10)
   0.5	11	5(1)	40.00(2/5)	40.00(2/5)	0
   0.5	11	9(2)	22.22(2/9)	22.22(2/9)	22.22(2/9)
   1	7	4	25.00(1/4)	25.00(1/4)	0
   总计	44	28	28.57(8/28)	25.00(7/28)	10.71(3/28)
   对照组	20	10	0	0	0

    注：产蛋数内括号中的个数表示软壳蛋数;用t检验进行差异显著性分析， *表示差异性显著。
   
   
3. 体外受精-体外发育试验结果
   试验2组中鸡卵体外受精后体外培养结果显示：10枚卵中，1枚受精，培养后发育到明暗区形成，但是比正常的明暗区形成时间要晚一些，以后没有进一步发育，说明体外受精卵可以在体外培养发育。但在本实验中,体外培养受精卵时,每只受精卵加入40 ml 新生蛋的卵白悬浮，在普通培养箱37°条件下进行培养，对其它条件如浓蛋白和稀蛋白比例、pH值、孵化环境等还需进一步研究探索。
   

溶液配方

1. C-2精子稀释液成份
   冰醋酸, 0.02 ml
   醋酸钠, 10 g
   NaHCO₃, 0.15 g
   磷酸氢二钾, 0.15 g
   葡萄糖, 10 g
   蔗糖, 40 g
   蒸馏水加至100 ml
2. 改良的 Ringer’s液配方
   NaCl, 145 mmol/L
   KCl, 2.68 mmol/L
   CaCl₂, 2.68 mmol/L
   NaHCO₃, 0.24 mmol/L
   硫酸链霉素, 1 g/L
   青霉素, 5000 IU/L
   

致谢

我们感谢李碧春, 陈国宏, 王克华, 丁家桐, 赵东伟, 孙寿永等人与本方案相关的前期研究工作。

参考文献

1. Tanaka, K., Wada, T., Koga, O., Nishio, Y. and Hertelendy, F. (1994). Chick production by in vitro fertilization of the fowl ovum. J Reprod Fertil 100(2): 447-449.
2. Petters, R. (1992). Embryo development in vitro to the blastocyst stage in cattle, pigs and sheep. Animal Reproduction Science - ANIM REPROD SCI 28: 415-421.
3. Howarth, B., Jr. (1970). An examination for sperm capacitation in the fowl. Biol Reprod 3(3): 338-341.