Tracer Migration of Chicken Primordial Germ Cells

材料与试剂

1. 新鲜受精蛋（扬州翔龙禽业发展有限公司）
2. Carnoy固定液（Solarbio，G2312）
3. 正丁醇（上海国药，71-36-3）
4. 氯化钠（上海国药，7647-14-5）
5. 中性树胶（Solarbio，G8590）
6. 石蜡（Leica，39601006）
7. 过碘酸（上海国药，10450-60-9）
8. 无水乙醇（上海国药，64-17-5）
9. 乙酸钠（上海国药，6131-90-4）
10. 浓盐酸（上海国药，6131-90-4）
11. 偏重亚硫酸钠（上海国药，7681-57-4）
12. 碱性品红（Solarbio，G8350）
13. 活性炭（Solarbio，C7261）
    

仪器设备

1. 孵化箱（无锡设备厂，鸣凤4820型）
2. 石蜡切片机（Leica，RM2245）
3. 光学显微镜（Olympus，BH2）
   

实验步骤

一、试验方法
将新鲜种蛋放入孵化箱内孵化。孵化温度为101℉（38.3℃），相对湿度为50~60%。孵化期间，按照Hamburger & Hamilton1分期标准，于孵育后有关各期取出鸡胚。每期取6枚，其中3枚用于整体装片染色，3枚用于石蜡切片染色。

1. 胚盘的取出
   （1）取出的种蛋，用眼科镊子轻轻敲击其钝端，小心去掉蛋壳和蛋壳膜使其约有3~4 cm直径的孔，暴露出卵黄及胚盘。
   （2）用眼科镊子顺着胚盘的边缘将胚盘剪下。
   （3）用药匙将胚盘取出，放入盛有温热（38~39℃）0.75%生理盐水的培养皿中，有卵黄膜的一面向上。
   （4）轻轻晃动培养皿，使卵黄和卵黄膜从胚盘上脱离下来。
   （5）倒掉培养皿内的大部分生理盐水，留下胚盘和少量生理盐水。
   （6）加入新的温热生理盐水，漂洗胚盘，依次重复三次。
   （7）将漂洗干净的胚盘移入Carnoy固定液中固定，过夜。
2. 胚胎的取出
   （1）同胚盘的取法一样，在种蛋的钝端用眼科镊子小心地取出胚胎。
   （2）置于盛有温热生理盐水的培养皿中。
   （3）剪去附带的卵黄囊及胚体周围的胚外膜。
   （4）用温热的生理盐水轻轻漂洗两次。
   （5）移入Carnoy固定液中固定24 h。
3. PAS法整体装片染色2
   （1）将固定好的胚盘或胚胎置于70%的酒精中清洗脱色24h。
   （2）取出胚盘置于过碘酸酒精溶液中（20℃）黑暗状态下氧化15分钟。
   （3）取出胚盘用70%酒精迅速漂洗片刻。
   （4）放入蒸馏水漂洗10 分钟。
   （5）取出胚盘或胚胎，放入希夫（Schiff）试剂中黑暗状态下染色30分钟。
   （6）置于蒸馏水中清洗10分钟。
   （7）依次经过50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精脱水，每次50~60分钟。
   （8）置于正丁醇中过夜透明。
   （9）第二天取出自然干燥，中性树胶封片。
   （10）用光学显微镜进行观察，拍照。
4. 石蜡切片染色
   （1）将固定好的胚盘或胚胎依次放入50%、70%、80%、90%、95%、100%酒精中脱水。
   （2）取出后置于正丁醇中透明24h。
   （3）浸蜡20~60分钟（胚盘需20~30分钟，胚胎需30~60分钟）。
   （4）石蜡包埋，大部分为纵切，小部分为横切，连续切片（厚度约7~8μm）。
   （5）于40%的酒精水溶液中展片，40℃的温水中烫片。
   （6）将切片置于载玻片上，置烘箱中50~60℃烘烤过夜。
   （7）脱蜡，二甲苯Ⅰ10min，然后二甲苯Ⅱ 10min (亦可用正丁醇24h替代) PAS染色同1.3、自然干燥、封片、显微镜观察。
   

结果与分析

1. 各期中PGCs的迁移、聚集及分布
   孵化前（鸡体内胚胎发育至19.5h）
   因为PGCs细胞质中含有丰富的糖原，而能被组织化学的染色方法PAS染色法染成紫红色。而细胞核不含糖原而染色后呈无色透亮且位于偏中央，核较一般细胞核大（图1），容易与体细胞区分。检查鸡体内胚胎发育到19.5 h时的连续切片，发现在已形成的明区中有3~4个染色相对淡的PGCs（图2、3），在暗区未发现PGCs。表明此期PGCs在鸡胚明区形成时已开始出现。
   
   
   图1. PGCs的基本形态，细胞核较大，细胞质中含有大量糖原，能被PAS染色法染成紫红色，1000X。
   
   
   图2, 3 胚胎发育到19.5 h时PGCs的分布与形态, 1000X
   
   第1期 原条前期（孵化3~4 h）
   在胚胎的连续切片中发现明区中有典型的PGCs分布，而在暗区中没有发现PGCs（图4）。
   
   
   图4 原条前期暗区没有PGCs分布, 1000X。
   
   第2期 原条早期（孵化6~7 h）
   细胞增厚区向头端发展形成锥条状结构，即原始状态的原条，明区中央较厚，而暗区和明区的交界处变得较薄，2个胚体的切片中检查，在暗区内侧边缘的地方有约4~5个PGCs分布在交界变薄的明区之中（图5）。
   
   
   图5 原条早期暗区边缘有PGCs分布, 1000X。
   
   第3期 原条中期（孵化12~13 h）
   明区和暗区交界的地方又变得较厚。明区中央已经形成条圆柱状的原条，其长度已达到明区总长的1/2。3个整装片中看到，此时胚体外左右两侧的明区近暗区的地方有较多的PGCs散在分布。平均每个胚胎左侧约有8~10个，右侧约有4~6个。
   
   第4期 原条末期（孵化19 h）
   此时期原条已接近于明区的全长，原沟、原窝和原结开始形成，原结在原条的最前端，原窝是原结中心凹下的窝穴，原条两侧颜色较深且较厚的区域为原嵴，其中间一条明亮的条状沟管为原沟，1个整装片中发现原条前端明区中有10~15个PGCs，而原条胚体左右两侧的明区中也有少量PGCs分布约4~5个，PGCs多为呈大而圆形的细胞，直径约12 μm。
   
   第5期 头突期（孵化22 h）
   此期已可见原条的原结之前伸有头突，3个整装片上均看到大量的PGCs聚集于头前侧部近暗区的明区生殖新月区中，平均每个胚胎左侧为18~22个，右侧有12~14个。在胚体尾侧部的明区中也可见1~2个PGCs分布（图6）。
   
   
   图6头突期暗区边缘有PGCs分布, 1000X。
   
   第9期 7对体节期（孵化32 h）
   胚体后端暗区中的血岛已形成，并向前扩展到胚体中部水平处。明区中的血管网也已形成。在胚体头前左侧的明区中发现有一伸出钝的伪足的PGCs（图7），1个胚胎的连续切片和1个整装片上分别看到有少量30~40个PGCs排列有序地分布于明区的血管中（图8）。
   
   
   图7,8 7对体节期PGCs分布, 1000X。
   
   第10期 10对体节期（孵化36h）
   胚体上出现10对体节，在近心脏的胚体两侧形成左右脐肠系膜静脉，并在明区中形成毛细血管网。暗区中的血岛已扩展到整个暗区，并与明区中的毛细血管网相连接。2个整装片上此时已可见少量PGCs进入到胚体内。其中在胚体的头部有10~12个PGCs，右侧倒数第7、8对体节间有1~2个PGCs。大量的PGCs仍分布于胚体外的明区血管中，左侧可见有30~35个PGCs，右侧有50~56个PGCs。
   
   第11期 13对体节期（孵化44 h）
   此期检查了3个胚胎的连续切片和整装胚的胚体。已形成13对体节，视泡明显，脑分化也明显。心脏向右突出于胚体外，其中2个胚胎的胚体内PGCs逐渐增多，平均每个胚胎的头部约有23~30个PGCs。左侧肠系膜静脉在进入胚体前的管腔中有4~6个PGCs，右侧有3~5个PGCs。大量的PGCs还是位于胚外明区血管中（图9、10），左侧约有52~60个PGCs，而右侧只有40~50个。但不论是左侧还是右侧，PGCs大多数分布于胚体头前部与侧部的明区中，而在靠近胚体中部与尾部的明区中却基本上无PGCs。此时的PGCs直径约为12μm。
   
   
   图9,10 13对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第12期 16对体节期（孵化48h）
   胚体内有16对体节，心脏已分化为心房和心室。检查3个整装片胚体PGCs的分布分别是：头部分布约有10~15个PGCs（图11、12），心脏中可见有1~2个PGCs，心脏的输出血管中分布较多，在40个以上（图13）。此外，胚体左侧倒数第3对体节处有1~2个PGCs。胚外明区血管中的PGCs数量比较第11 期的逐渐减少，左侧约有21~25个PGCs，右侧有20~25个PGCs，在身体两侧的分布相等。
   
   
   图11-13 16对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第13期 19对体节期（孵化52 h）
   此期中，PGCs的数目急剧增加，在所记录的3个整装片中有一个胚体中的PGCs聚集于头部和心脏中（图14、15）。其中头部前脑和中脑附近的小血管中分布约有50~ 55个PGCs，心脏中约有45~50个PGCs。此外，与心脏呈水平位置的胚体血管中约有18个PGCs。胚体左侧明区血管中有约27~30个PGCs，右侧有16~20个PGCs（图16、17）。本期研究结果像12期一样，大部分PGCs仍旧分布于头间充质血管中，约占50%以上，在心脏中也约占有40%的PGCs分布。
   
   
   图14-17 19对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第14期 22对体节期（孵化53 h）
   一个整装片中胚体头部间充质血管中约有18个PGCs，其中有一个PGCs位于与视杯水平的头部外胚层表面。心室里有5个PGCs，背主动脉血管中有20个PGCs。胚体右侧第4对体节水平有1个PGCs，第7、10、13对体节处各有1个PGCs，18~20对体节处有4个PGCs，脐肠系膜动脉中有1个PGCs，脐肠系膜静脉中2个PGCs。而在体左侧，第10对体节处有4个PGCs，第12对体节处有2个PGCs，第16~17对体节处有1个PGCs，19~20对体节处有1个PGCs，第22对体节处（未来性腺形成区）有1个PGCs。
   
   PGCs随机分布于身体区域的间充质中。另一个样品切片中，大部分PGCs仍位于头部间充质或大血管腔中，其中3个位于18~20对体节体腔底壁上皮和背侧的脏壁中胚层中，1个位于靠近第21对体节处。实验结果显示，在12-14期，PGCs主要集中于大血管的管腔中和尤其是头部间充质的小血管中。
   
   第15期 约24~27对体节期（孵化54 h）
   一个整装片上除了头部及头部边缘还可见有许多PGCs（约20个）外（图18），其它部位基本上已看不到PGCs，明区中的血管内几乎看不见PGCs。另一个样本切片中PGCs分布发生了较大的变化，平均20个位于头部间充质中，其余约40多个位于心脏和背主动脉以及脐肠系膜动脉之间的广大区域中（图19、20），此时切片观察几乎脏壁层和体壁层覆盖体腔的体腔上皮整个部分增厚。上皮细胞呈圆柱状，核呈梭形。但体腔上皮及周围邻近区域未见有PGCs出现，说明PGCs还未到达这个区域。
   
   
   图18-20 22对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第16期 约26~28对体节期（孵化56 h）
   约27对体节，胚体上PGCs急剧增加，所观察的3个胚胎整装片中每一个胚胎中的PGCs数目变化范围在95~130之间，头部约25~33个PGCs，心脏有2~4个PGCs，心脏输出血管中有12~16 个PGCs，与心脏位置水平的背主动脉中有27~31个PGCs。于右侧倒数8~10对体节成水平位置处的血管中有15~18个PGCs，左侧有10~15个PGCs。紧靠胚体的卵黄动脉中，左侧有2~4个PGCs，右侧有2~6个PGCs。切片中观察到，脏壁层在靠近体腔角的区域出现体腔上皮进一步增厚，PGCs主要集中分布在增厚的体腔上皮中，个别的PGCs分布在附近的间充质及血管中。PGCs胞体大、细胞质清楚，容易与周围细胞区别。说明在鸡胚胎发育的16期时，PGCs进入体腔上皮增厚区。此期，在头部仍见有PGCs进入间充质血管中，在尾部血管中亦见有PGCs出现。
   
   第17期 约29~32对体节期（孵化62 h）
   整装片观察眼睛附近及边缘区共有约30个PGCs，此时可见大量PGCs位于胚体倒数第1~8对体节间的未来性腺区域中（图21）。整装片观察，胚体上左侧有50个以上，右侧有30个以上，约有60%的PGCs分布于未来性腺区，其余的PGCs则位于胚体头、心脏及大血管中。由于是整装片观察，有些不易看到，估计实际数值比此量多。在倒数第1对体节处有2个PGCs紧靠在一起，像是刚发生分裂而尚未分离开的2个细胞（图22）。与前期相比，位于头部间充质中的PGCs稍有下降，而性腺区中的PGCs却有增加。在切片中增厚上皮及其周围和血管中均发现有PGCs。
   
   
   图21,22 29~32对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第19期 约37~40对体节（孵化3d）
   连续纵切片观察，一个胚体上眼睛周围有6个PGCs，第2~4对体节处的身体间充质中有6个PGCs，近头侧的背部胚外膜中可见4个PGCs。大部分约80%的PGCs分布于未来的性腺区域（图23、24）。与胚体轴垂直的连续切片中，发现大量的PGCs集中分布于胚体左右两侧增厚的体腔脏壁上皮中，为生殖嵴增厚区。左右两侧的PGCs数目大致相等（图25、26）。
   
   
   图23~26 37-40对体节期PGCs分布，1000X。
   
   第22期（孵化约3.5d）
   连续纵切片，发现胚体中已开始形成中肾管，在中肾管的内侧性腺中已明显形成，但与中肾仍有大部分连系在一起，彼此没有分开。有大量的PGCs集中位于性腺和中肾后端外侧部中，清楚可见。PGCs的形状和大小发生了很大的变化，有些呈圆形或椭圆形，有些好像才发生过分裂，有些由于出现钝的伪足而呈拉长的形状（图27-30），如为长形细胞，则长轴约25 μm，短轴约10 μm，核直径约8μm。在试验中这些测量值仅仅代表PAS反应阳性而被染色的细胞质区域的大小，细胞膜通常染色不明显。因此，在PAS染色情况下得出的细胞要比其它细胞学染色所得的结果小。但PGCs仍在生殖嵴中呈无序分布（图28），PGCs胞质中糖原开始崩解（图30）。
   
   
   图27-30 孵化约3.5d 的PGCs分布，1000X。
   
   第27期（孵化5d）
   中肾明显发育，中肾小管类似于成体的肾组织，肾小球已形成，原始性腺紧贴其内侧缘，与中肾分开。且性腺较为膨大而细长，大量的PGCs位于其中，但此时的PGCs胞质中的糖原颗粒已经处于崩解状态，但仍能看清胞质中糖原颗粒分布的基本特征（图31、32）。此时PGCs在性腺中的分布出现了两种情况，第一种情况是，PGCs整齐地排列在性腺靠远侧部，即生殖上皮中（图33）。第二种情况是，PGCs在性腺中，集中靠近侧部分布（图34、35），这种情况的分布可能是雌、雄性腺开始分化的标志。第一种情况可能向雌性方向发育，第二种情况可能向雄性方向发育。但从性腺结构特征上仍分不出雌、雄性。这一结果表明，PGCs的确是进入到性腺中性腺是由PGCs与体腔上皮增厚区所组成。
   
   
   图31-35孵化约5d 的PGCs分布。
   
   第29期（孵化6d）
   此期，生殖腺更为膨大，可明显区分为致密的周边层和较稀琉的内部区，显示为卵巢特征。PAS染色发现PGCs染色更淡且有的位于生殖腺内部，部分PGCs开始逐渐向生殖上皮迁移（图36），PGCs细胞质中的糖原颗粒崩解且分布稀疏杂乱（图37），说明生殖腺开始分化，此时的生殖腺应称为性腺。
   
   
   图36,37孵化约6d 的PGCs分布。
   
   第31期（孵化7 d）
   此时，PGCs用PAS染色已观察不到，说明随着性别分化，性腺中PGCs转变为卵原或精原细胞的过程中，糖原消失。
   

溶液配方

1. 0.75%生理盐水：3.75 g氯化钠+500 mL蒸馏水。
2. 过碘酸酒精溶液：0.4 g的过碘酸+35 mL的95%酒精+5 mL的M/5乙酸钠(2.72g乙酸钠+蒸馏水100 mL)+10 mL的蒸馏水，用棕色瓶包装后保存于4℃冰箱。
3. 1N盐酸：浓盐酸 (比重1.19 含量 22%)8.5 mL，加蒸馏水 91.5 mL。
4. 偏重亚硫酸钠：1N盐酸7.5 mL加10%偏重亚硫酸钠7.5 mL,再加130 mL蒸馏水混合而成。
5. 希夫（Schiff）试剂：0.5克碱性品红加入100 mL蒸馏水中，不断摇动锥形瓶5分钟,使之充分溶解。冷却至50℃后过滤加入10 mL的1N盐酸。冷却至25℃，加入0.5克偏重硫酸钠。在室温中静置24小时，溶液为淡黄或淡红色 ,再加入活性炭 5 g，混合后振荡数分钟，静置 1 h，再用双层滤纸过滤，此时溶液应完全无色、清澈透明，为无色品红。封口，贮存于棕色瓶中 (最好外包黑纸避光 )存放入 4℃冰箱备用。
   

致谢

本研究得到了国家自然科学基金资助项目（31872341；31572390）、重点科研项目（2017YFE0108000）和江苏省优势学科的资助。感谢李碧春教授3的研究工作。

参考文献

1. Hamburger, V. and Hamilton, H. L. (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol 88(1): 49-92.
2. Zuo, Q., Zhou, J., Wang, M., Zhang, Y., Chen, G. and Li, B. (2020). Study on the Function and Mechanism of Lin28B in the Formation of Chicken Primordial Germ Cells. Animals (Basel) 11(1).
3. 李碧春. 生产转基因鸡基础理论和方法的研究[D].西北农林科技大学, 2000.