Rapid Sex Identification of Chicken Embryo

材料与试剂

1. 1.5 ml EP管（AXYGEN，Lot No. 23719392）
2. PCR管（AXYGEN，Lot No. 30217302）
3. 10 μl微量移液器枪头（AXYGEN，Lot No. 32119391）
4. MightyAmp^TM DNA Polymerase Ver.3（TAKARA, Code No.R076A），-20 °C保存
5. 2× MightyAmp Buffer Ver.3（TAKARA, Code No.R076A），-20 °C保存
6. Premixed TAE Buffer, 10x（Sigma-Aldrich，catalog number: 11666690001），常温保存
7. 溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）（Sigma-Aldrich，catalog number: E7637），常温保存
8. 琼脂糖（Agarose）（Sigma-Aldrich，catalog number: A9539），
9. DL 5000 DNA Marker（TAKARA, Code No.3428A），4℃保存
10. 10x Loading Buffer（TAKARA, Code No.9157），常温保存
11. 50x TAE 缓冲液（Solarbio，catalog number: T1060），常温保存
12. 1× PBS缓冲液（Solarbio，catalog number: P1020），常温保存
13. Chicken-CHD 引物（由Invitrogen上海公司合成部合成）
14. 酒精
15. 蒸馏水
    

仪器设备

1. 镊子
2. 2 μl微量移液器（Eppendorf，Eppendorf Reference^® 2, catalog number: 4921000028）
3. 10 μl微量移液器（Eppendorf，Eppendorf Reference^® 2, catalog number: 4921000052）
4. PCR管离心机（Eppendorf，MiniSpin^® plus 5, catalog number: 452000093）
5. PCR仪（Applied Biosystems，型号：2720）
6. 微波炉（Galanz，型号：P7021T9-6）
7. 分析天平（METTLER TOLEDD，型号：AL204）
8. 电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY6C）
9. 显像仪（Bio-Rad ChemiDocTM Imaging System，733BR2897）
10. 去离子水仪（Sartorius，Arium®Pro）
11. 孵化箱（无锡设备厂，鸣凤4820型）
    

实验步骤

一、样本采集

1. 早期胚胎组织样本采集
   使用血液能够准确的鉴定出鸡胚的性别，而鸡胚发育（<Stage 8，鸡胚的背主动脉在Stage 8生成）早期样本中无血液，在此阶段需要组织样本悬液进行鉴定。按照实验需求在对应的发育时期取出胚蛋，首先使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗，再使用75%酒精进行擦拭，使用手术镊子轻轻敲开胚蛋顶部，寻找胚胎组织，轻轻的夹取并将胚胎转移到加入适量PBS的EP管中（注释：样本夹取一定小小心，避免破坏胚胎组织影响后续实验），标记后吸取2 μl PBS悬液进行鉴定（注释：样本一定要进行标记，尤其是采集大量样本时），胚胎样本按照实验需求进行对应处理。
2. 胚胎血液样本采集
   胚胎血管（>stage8）形成后，即可在采集胚胎样本的同时吸取少量血液进行鉴定。按照实验需求在对应的发育时期取出胚蛋，首先使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗，再使用75%酒精进行擦拭，使用手术镊子轻轻敲开胚蛋顶部并夹出胚胎样本，此时即可使用微量移液器吸取2 μl胚外血管中的血液进行鉴定（注释：血液吸取时可能会带入一些卵黄或卵清等组织，太多会影响鉴定的准确性），胚胎样本按照实验需求进行对应处理。
3. 胚胎尿囊液样本采集
   在胚胎发育后期（16-18胚龄），可通过穿刺吸取尿囊液来鉴定胚胎性别而不会影响胚胎的正常的发育。同样的，按照实验需求在对应的发育时期取出胚蛋，首先使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗，再使用75%酒精进行擦拭，使用注射针在胚蛋尖端位置轻轻戳出一个小孔，通过1 ml注射器吸取胚蛋中尿囊液进行鉴定，吸取后使用医用胶带封住小孔，放回孵化箱继续进行孵化。

1. 引物合成
   用于鸡性别鉴定引物序列为CHD-F:5’ CTGCGAGAACGTGGCAACAGAGT3’; CHD-R: 5’ATTGAAATGATCCAGTGCTTG3’.由上海生工公司合成，引物工作浓度为10 μM。
2. PCR鉴定体系
   PCR扩增体系：采集的样本进行标注，并吸取2 μl进行PCR反应，使用微量移液器在PCR管中依次加入10 μl 2× MightyAmp Buffer，5.6 μl去离子水，Forward/Rewardprimer和MightyAmp DNAPolymerase，最后加入2 μl样本使用微量移液器轻轻吹打均匀，使用离心机将PCR管内液体进行离心。
   PCR扩增程序：将PCR管置入PCR仪，设置PCR反应程序，98 °C预变性3分钟，25个循环反应（98 °C 15秒，59 °C 15秒，72 °C 15秒），72 °C延伸10分钟，反应体积为20 μl。反应结束后加入10x LoadingBuffer，如不能立即电泳，可暂时置于冰上或4 °C冰箱保存[1,2]。
3. 凝胶电泳与成像鉴定
   在锥形瓶中使用TAE Buffer溶解琼脂糖粉末，比例为2%，使用微波炉进行加热，使粉末完全溶解在TAE Buffer中。将溶液倒入电泳模具中，插入梳子，凝固后将凝胶放入加满TAE Buffer的电泳槽中，分别在凝胶孔中加入DNA ladder Marker和PCR反应液，设置电泳仪电压，确保电泳电压为15V/cm，电泳15分钟后，将凝胶取出，浸泡在EB溶液中进行染色。染色结束后放入成像仪，在Bio-Rad ChemiDoc^TM Imaging System中的UV光下成像并拍照，使用Iamge Lab5.0软件进行分析。
   
   

三、鸡胚性别的解剖学鉴定
在鸡胚发育后期（>12胚龄），由于鸡的雌性存在不对称发育的特点，其左侧性腺相较于右侧性腺较大，由此鸡胚的性别可以通过解剖进行鉴定。使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗，再使用75%酒精进行擦拭，使用手术镊子轻轻敲开胚蛋顶部并夹出胚胎样本，使用镊子撕去系带组织，用剪刀剪开腹腔，使用镊子将肠道组织移出，即可看到肠道下方的性腺组织。比较左侧和右侧的性腺大小，即可判断鸡胚性别：雄性鸡胚两侧性腺大小一致，沿背中线对称分布，略有弯曲呈八字型，其外观通常呈米粒状；雌性鸡胚右侧性腺组织退化为丝状，左侧性腺膨大，其外观边缘不规则。

结果与分析

1. 鸡胚性别的解剖学差异
   选取两性出壳小鸡，同时进行PCR鉴定和解剖学观察，PCR结果显示雌性（ZW）会出现两条大小不一的条带，而雄性（ZZ）则只有一条。进一步的解剖结果显示雄性鸡胚两侧性腺大小一致，沿背中线对称分布，略有弯曲呈八字型，其外观通常呈米粒状；雌性鸡胚右侧性腺组织退化为丝状，左侧性腺膨大，其外观边缘不规则[3]（图1B）。
   
   
   图1. 鸡胚性别鉴定. A. PCR鉴定结果，M为DL5000 Marker；B. 解剖学检测结果
   
   
2. 使用鸡胚组织悬液/血液/尿囊液进行PCR鉴定
   选取10个18胚龄胚蛋，吸取尿囊液后进行PCR检测，同时标号后放入孵化箱进行孵化，出壳后进行解剖学观察。结果显示PCR鉴定结果与解剖学观察结果一致（图2A），表明该技术能够有效的在不影响孵化的情况下鉴定鸡胚性别。与此同时，分别选取10只新出生小鸡，分别提取组织悬液和血液进行PCR检测和解剖学观察。结果显示组织悬液（图2B）和血液（图2C）PCR鉴定结果与解剖学观察结果一致，表明该技术能够通过血液和组织悬液有效准确的鉴定性别。
   
   
   图2. PCR鉴定结果与解剖学鉴定结果. A. 18胚龄胚蛋尿囊液检测结果；B. 初生小鸡组织悬液检测结果；C. 初生小鸡血液检测结果
   

失败经验

1. PCR检测十分灵敏，因此避免检测样本的污染十分重要。
2. 尿囊液获取时间段为17-19日胚龄，时间过早则尿囊液中无足够DNA进行鉴定，过晚则尿囊液较少，无法正常吸出。
3. 过多的卵黄或卵清在PCR过程中会发生变性凝固，破坏PCR的体系，影响鉴定的结果。如果采集的样本中混入过多卵黄或卵清而又未保存其他样品，可将样本使用PBS缓冲液进行稀释，使卵黄和卵清在上样样本中的占比减少。
   

致谢

我们在此感谢李碧春，陈国宏，张亚妮，左其生，张振涛和施青青等人的前期研究工作。

参考文献

1. 李治利, 秦清明, 施振旦, 陈海南, 和黄群山. (2012). 微量全血pcr技术鉴定雏鸡及鸡胚性别. 中国畜牧兽医, 09:74-79.
2. Clinton, M., Haines, L., Belloir, B. and McBride, D. (2001). Sexing chick embryos: A rapid and simple protocol. Br Poult Sci 42(1): 134-138.
3. Zhang, Z., Elsayed, A. K., Shi, Q., Zhang, Y., Zuo, Q., Li, D., Lian, C., Tang, B., Xiao, T., Xu, Q. et al. (2015). Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. J Biol Chem 290(21): 13605-13621.