Intravascular Injection of Chicken Embryos

材料与试剂

1. 玻璃针 (NARISHIGE, catalog number: G-1)
2. 微量上样枪头, Microloade (Eppendorf, catalog number: H129975M)
3. 医用胶带
4. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco®, catalog number: 11960044)
5. PBS, pH 7.4 (Phosphate-Buffered Saline) (Gibco®, catalog number:10010023)
6. 0.4%台盼蓝染液 (Trypan Blue solution) (Sigma-Aldrich, catalog number:T8154)
7. PEI (Polyfectine) (Biowit, catalog number: PL0001)
8. 青链霉素 (Solarbio, catalog number: P1400)
9. 灭菌蒸馏水
   

仪器设备

1. 手术镊
2. 眼科镊
3. 拉针仪 (NARISHIGE, model: PC-100)
4. 磨针仪 (NARISHIGE, model: EG-401)
5. 37 °C培养箱 (Thermo scientific, model: 4110)
6. 体视显微镜 (OLYMPUS, model: MVX10)
7. 10 μl微量移液器（Eppendorf，Eppendorf Reference® 2, catalog number: 4921000052）
8. 显微注射仪 (NARISHIGE, model: UT10)
9. 孵化箱(无锡设备厂，型号：鸣凤4820型)
   

实验步骤

一、注射针制备
取玻璃针置于拉针仪，固定好后点击Turn on 按钮，将拉好的玻璃针固定于磨针仪上，打开磨针仪开关，在观察视野下轻轻推动针尖至磨针仪转盘上，同时滴加灭菌蒸馏水，针尖出现45°切口后将玻璃针取出，置于紫外灯下消毒2小时以备注射用。

二、鸡胚血管注射

1. 注射外源物质准备
   1. 载体准备：普通的转染载体可通过与脂质体混合，一般而言，质粒需要经过去内毒素处理，脂质体可选用PEI或其他商品化脂质体试剂。转染前，将转染质粒（质量）与脂质体（体积）以1:3的比例混合后置于37 °C培养箱孵育20分钟备用。
   2. 慢病毒载体制备：注射用的慢病毒载体滴度应至少为5 × 10⁶ Tu/ml,注射前计算好注射剂量和浓度，将慢病毒置于冰上融化备用。
   3. 鸡PGCs：培养的鸡PGCs或修饰后的PGCs经过计数后，将PGCs使用DMEM稀释至注射浓度，按照1,000-1,500个细胞/胚进行注射，注射量不大于5 μl。
2. 鸡胚血管寻找
   取新鲜受精蛋，置于孵化箱中孵化至48-58 h（13-17 HH），使用新洁尔灭对蛋壳进行浸泡和清洗，再使用75%酒精进行擦拭，使用手术镊子轻轻敲开胚蛋顶部，打开一个直径不大于1 cm的圆孔，在体视显微镜下找到胚胎位置，在体视显微镜下使用眼科镊轻轻挑开外壳膜，露出胚胎血管。
3. 鸡胚血管注射
   将需要导入的外源物质使用微量移液器通过枪头填入玻璃针（注释：填入过程应缓慢吸取和填入，避免气泡冲入玻璃针），然后根据注射量调整注射器气压，在体视显微镜下缓慢沿胚胎背主动脉血管方向刺入注射针，将外源物质注入。
4. 注射后处理
   注射后加入200 μl青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。继续放入孵化箱，孵化温度为38 °C，湿度为80%，根据后续实验需求进行处理（详细过程见图1）。
   
   
   图1. 血管注射流程. A. 注射时间和流程示意图；B. 注射位置示意图，1标示为头部血管，2为背主动脉血管；C. 血管注射流程示意

结果与分析

1. 示踪染液注射后扩散情况
   使用0.4%细胞染色液台盼蓝进行注射，注射剂量为2 μl，注射位置为头部血管和背主动脉，可观察到蓝色染液随胚胎血管弥散至全胚，表明血管注射能够有效的使外源物质进入胚胎[2]（图2）。
   
   
   图2. 示踪染液注射后扩散情况. 标尺：50mm
   
   
2. 外源载体注射结果
   对pEGFP-N1载体进行PEI包裹，使注射液浓度为1 μg/μl，同时包裹慢病毒载体pLVX-EGFP，滴度测定后进行稀释，使病毒浓度为5 × 106 Tu/μl。对发育至2.5天胚胎分别注射包裹好的pEGFP-N1和pLVX-EGFP，4.5天将胚胎取出，置于体视荧光显微镜下观察，结果表明注射后载体携带的绿色荧光蛋白能够有效的在胚胎中表达（图3）。
   
   
    图3. 慢病毒载体和包裹质粒注射后绿色荧光的表达. 标尺：100 mm
   
   
3. PGCs注射结果
   使用细胞膜染液将供体PGCs的细胞膜染成红色后进行注射，在18.5天时将供体胚胎的生殖腺（睾丸和卵巢）取出，固定后进行冰冻切片，结果显示，供体PGCs能够有效的进入受体的生殖腺并定居[3]（图4）。
   
   
   图4. 供体PGCs（红色）注射后受体生殖腺冰冻切片. 标尺：2 mm
   

致谢

我们在此感谢李碧春，陈国宏，张亚妮，赵瑞丰等人的前期研究工作。

参考文献

1. Kawabe, Y., Naka, T., Komatsu, H., Nishijima, K., Iijima, S. and Kamihira, M. (2008). Retroviral gene transduction into chicken embryo gonads through blood circulation. J Biosci Bioeng 106(6): 598-601.
2. Wang, Y. l., Jin, K., He, N. N., Cheng, S. Z., Zuo, Q. S., Li, D., Wang, Y. J., Wang, F., Ji, Y. Q., Lu, Z. Y. et al. (2017). Research on the appropriate way to transfer exogenous substances into chicken embryos. J Integr Agric 16(10): 2257-2263.
3. Furuta, H., Marumiya, S., Nakano, I., Yoshida, T., Mukouyama, H. and Tanaka, M. (2007). Effect of Transfer Primordial Germ Cells (PGCs) into Chick Gonad. J Poult Sci 44: 335-338.