Early Embryonic Development in Chickens

材料与试剂

1. 粘附载玻片（PCI系列）（江苏世泰实验器材有限公司，世泰，产品目录号：80313-7161-16）
2. 正常产蛋乌骨鸡母鸡（江苏省家禽研究所）
3. Rossman固定液（北京华越洋生物，华越洋，产品目录号：WG06773）
4. 无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，沪试，产品目录号：1009218）
5. 正丁醇（国药集团化学试剂有限公司，沪试，产品目录号：10005218）
6. 氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，沪试，产品目录号：10019318）
7. 中性树胶（北京索莱宝科技有限公司，Solarbio，产品目录号：G8590）
8. 0.75%氯化钠（见溶液配方）
9. 70%（80%、90%）无水乙醇（见溶液配方）
   

仪器设备

1. 奥林巴斯研究级显微镜（奥林巴斯株式会社，奥林巴斯，BH2）

实验步骤

1. 将经过人工授精的产蛋母鸡单笼饲养。于每日清晨六点开始仔细观察并记录每一只母鸡产蛋的精确时间。在产前一个蛋后的不同时间点收集受精卵，即在4 h、5 h、5.5 h、6 h、6.5 h、7.5 h、8.5 h、9.5 h、10.5 h、11.5 h、12.5 h、13.5 h、14.5 h、15.5 h、17.5 h、19.5 h、21.5 h、22.5 h和23.5 h分别将鸡处死（处死前，先用手指伸入鸡泄殖腔内检查是否有蛋），剖腹，从输卵管或子宫中取出发育的受精卵，每个时间点取3个蛋。
2. 将取出的蛋放入培养皿中，用镊子去除表面的蛋壳、壳膜和卵白等物质，滴加Rossman固定液于胚盘上，10 min后取出胚盘，放入40 °C、0.75% 的生理盐水中漂洗以去除附着的卵黄颗粒。接着，将蛋置于Rossman固定液中固定20分钟后，再依次放入70%、80%、90%、100%的无水乙醇中逐级脱水，每次脱水时长约1 h。最后，将蛋置于正丁醇中透明过夜，取出蛋后迅速用中性树胶封片，显微镜观察、记录、拍照。
   

结果与分析

产蛋周期长的母鸡每隔25-26 h就排一枚卵，卵的主要组成是卵黄和位于上方直径约2-3 mm的盘状细胞质，细胞核位于其中。排出的卵在输卵管喇叭口受精，之后经过5 h的下行进入子宫，期间卵被子宫不同区域腺体分泌的蛋清和壳膜逐渐包裹，并在子宫肌肉蠕动作用下围绕长轴以10-15r/h的速度旋转20 h，最后在软壳膜上沉积钙，形成硬壳后产出。在通过鸡输卵管和子宫的整个过程中，受精卵完成分裂发育，这一过程被称之为鸡胚胎体内早期发育的时期。在本实验中，按照受精卵分裂过程中的形态变化标准及受精卵在输卵管和子宫中停留的时间来分，共分为二个阶段：卵裂阶段（第一阶段）；明区形成阶段（第二阶段）。结果如下：

1. 卵裂阶段
   1. 产蛋后4 h（0 h子宫龄）：
      此时，受精卵位于输卵管峡部，卵黄被一层浓蛋白包裹，胚盘上没有分裂沟（图1）。
      
      
      图1. 产后4 h(HH1)受精卵（200X）
      
      
   2. 产蛋后5 h（0-0.5 h子宫龄）：
      受精卵的大部分位于输卵管峡部，小部分已经进入子宫部，胚盘中央出现一条分裂沟。由于鸡卵是极端的端黄卵，卵黄特别多，因此分裂只限于核所在的区域，下面的卵黄不分裂。此时的分裂沟是纵裂，分裂沟穿过胚盘中心部分，形成两个不完全分开的分裂球（图2）。
      
      
      图2. 产后5 h受精卵（400X）
      
      
   3. 产蛋后5.5 h（0-1 h子宫龄）：
      此时，受精卵的一半在输卵管的峡部，一半在输卵管子宫部，已经形成一层不结实的厚壳膜，卵黄外、壳膜内的蛋白质非常浓稠，呈粘胶状。整个胚盘尤如一个很大的细胞，直径约1,350 μm，胚盘中央出现第二次分裂，分裂沟与第一次垂直，形如十字形，分裂成四个不完全的分裂球（图3、4）。
      
      
      图3. 产后5.5 h受精卵（200X）
      
      
      图4. 产后5.5 h受精卵（400X）
      
      
   4. 产蛋后6 h（1 h子宫龄）：
      受精卵大部分位于子宫部，已可见3次卵裂，8细胞期。细胞位于同一平面上，但看不出细胞之间有明显的界限，只看见分裂沟，在未分裂的细胞质上存在较大的腋泡（空泡）。在这个分裂期内，分裂是在垂直于第一次分裂沟的基础上，再发生了两次分裂。
   5. 产蛋后6.5 h（1-1.5 h子宫龄）：
      此时的受精卵已经全部位于子宫，厚壳膜上还未有钙质沉积。整个胚盘直径约1,800 μm。中央已可见4次分裂，约12-16个卵裂球。有分裂球的区域直径约
      850 μm。分裂的细胞很不规则，直径大小在16-20 μm，仍位于同一平面上（图5）。
      
      
      图5. 产后6.5 h受精卵（400X）
      
      此期的中央细胞由于分裂沟的水平伸展而开始与卵黄分开，纵横交错的分裂沟逐渐在交叉的地方相遇汇合，形成一个个充满液体的不规则的分裂球。分裂沟从中央伸向周边。
   6. 产蛋后7.5 h（2-2.5 h子宫龄）：
      此时，整个胚盘约有40个卵裂球，中间部分的卵裂球较小，约有20个，分裂沟较为明显，且多向延伸，然而周边卵裂球间的分裂沟并不明显。所有卵裂细胞只有一层，形状极不规则，有的呈四方形，有的呈梯形，有的呈三角形，直径约15~20 μm，处于同一平面上。分裂沟辐射延伸到胚盘边缘（图6、7）。
      
      
      图6. 产后7.5 h受精卵（200X）
      
      
      图7. 产后7.5 h受精卵（400X）
      
      
   7. 产蛋后8.5 h（3-3.5 h子宫龄）：
      胚盘中央约有64个卵裂球，已分裂6次。分裂球直径约为9~15 μm，大小各异，形状不规则。整个胚盘的直径约为3,300 μm，中间分裂球区域的直径约为1,500 μm，分裂球与下面的卵黄分离，成为一层完整的细胞，称为中央细胞。周边分裂沟非常明显地呈辐射状（图8）。胚盘外周的分裂球与卵黄仍然相连，称为边缘细胞。
      
      
      图8. 产后8.5 h受精卵（200X）
      
      
   8. 产蛋后9.5 h（4-4.5 h子宫龄）：
      胚盘卵裂球数约120个，卵裂区域直径为2,600 μm，分裂球大小规则，中间较小，约10~12 μm，周边较大约为16~20 μm，并呈各种形状（图9、10）。此时，细胞分裂不但在水平面上，而且在垂直面上。
      
      
      图9. 产后9.5 h受精卵（200X）
      
      
      图10. 产后9.5 h受精卵（400X）
      
      
   9. 产蛋后10.5 h（5-5.5 h子宫龄）：
      此时约有185个卵裂球细胞，但还只是一层细胞。细胞大小明显分为三圈，中心部分的细胞较小，直径约6 μm，次周边的细胞较大且形状不规则，直径约11 μm；最边缘一圈是更大的细胞在未染色的情况下，750倍镜下可见细胞质内充满卵黄颗粒（图11、12），整个胚盘的细胞质已经完全分裂开。
      
      
      图11. 产后10.5 h受精卵（200X）
      
      
      图12. 产后10.5h受精卵（400X）
      
      
   10. 产蛋后11.5 h（6-6.5 h子宫龄）：
       基本同10.5 h ，胚盘中间部分的分裂均匀，细胞直径在4~7 μm之间。周边的细胞较大。中间部分的细胞约有2层，均匀致密，像哺乳动物胚胎的桑椹期，发育过程类似于哺乳动物胚胎的发育（图13）。
       
       
       图13. 产后11.5 h受精卵200X
       
       
   11. 产蛋后12.5 h（7-7.5 h子宫龄）：
       约300~400个卵裂球，囊胚期开始，中央部分的细胞较小，形状不规则，约5~6 μm，而且周围的细胞较大，约8~10 μm，最边缘的细胞更大，约8~10 μm，是分裂沟的延伸，胚盘直径约3,000 μm。此期细胞界限明显，且能清楚地看见一个个分裂球。在此期可获取胚胎单个细胞分裂球（图14）。
       
       
       图14. 产后12.5 h受精卵400X
       
       
   12. 产蛋后13.5 h（8-8.5 h子宫龄）：
       约800-1,000个卵裂球，中心区增厚出现二层细胞，细胞直径约2 μm，形状较为规则，次周边细胞直径约6 μm，最边缘的细胞经过分裂后，已形成约12 μm大小不规则的细胞。此时，可获取更多的单细胞分裂球（图15）。
       
       
       图15. 产后13.5 h受精卵200X
       
       
   13. 产蛋后15.5 h（10-10.5 h子宫龄）：
       此时，约有2000个卵裂球细胞，胚盘周边较薄，而中间区域明显地增厚，厚约6~7层细胞，中央区域的分裂球直径大小约为3~5 μm，周边区域的细胞直径大小约为10 μm。整个胚盘上细胞分裂沟均匀分布在胚盘的尾端，细胞开始向前端扩散，胚盘此时无显著的明暗区之分（图16）。胚胎横切面切片观察，此时胚盘分裂已有7个细胞层，可明显地看到3层细胞组成的上胚层（图17）。此时，细胞层开始与卵黄间分开，类似于哺乳动物的早期囊胚。
       
       
       图16. 产后15.5 h受精卵400X
       
       
       图17. 产后15.5 h受精卵400X（横切面）
       
       
       
2. 明区形成阶段
   1. 产蛋后17.5 h（12-12.5 h子宫龄）：
      此时胚盘开始出现明暗区之分。明区已经扩展到尾端两边，形成镰刀样区域，直径约2,450 μm，整个周边变为暗区，直径约为400 μm。明区中的细胞大小趋于均匀，直径约4 μm。尽管将显微镜倍数放大至400倍，但仍较难分清细胞间的界限（图18）。胚胎横切面切片观察，可见上胚层已有3层细胞紧密联系在一起，整个胚胎有8层细胞（图19）。
      
      
      图18. 产后17.5 h受精卵200X
      
      
      图19. 产后17.5 h受精卵400X（横切面）
      
      
   2. 产蛋后19.5 h（14-14.5 h子宫龄）：
      此时，肉眼可见胚盘有明显的明暗区之分，暗区直径约400 μm，明区直径约为3,900 μm。明区有2层细胞，细胞大小比17.5 h更趋均匀，直径约2 μm，透光率明显增强，但靠近卵黄层的地方仍有大的细胞不均匀地分布于整个胚盘（图20）。
      
      
      图20. 产后19.5 h受精卵200X
      
      
   3. 产蛋后21.5 h（15-15.5 h子宫龄）：
      胚盘明区、暗区十分清楚，中央只有一薄层细胞，暗区直径约为600~700 μm，整个胚盘中细胞大小均匀，直径约为1.5~2 μm，均呈球形（图21）。
      
      
      图21. 产后21.5 h受精卵200X
      
      
   4. 产蛋后22.5 h（16-16.5 h子宫龄）：
      基本同21.5 h（图22），中间细胞均匀一致（图23），且尚未进入分化期。
      
      
      图22. 产后22.5 h受精卵200X
      
      
      图23. 产后22.5 h受精卵400X
      
      
   5. 新生蛋（19-19.5 h子宫龄）：
      胚盘直径约3,950~4,000 μm，暗区直径约600~650 μm，明区与暗区交界处有一个宽350 μm的单细胞隔离带。此时，明区中央细胞又增厚到2~3层，且增厚区呈圆形。分裂细胞更小，趋于均匀一致，直径约为1~1.5 μm细胞内含有丰富的脂滴；暗区宽度为600-650 μm（图24）。此时不仅是胚盘在体内发育的结束，而且是上胚层形成的开始，此时获取分裂球作转基因或制作嵌合体比较合适。
      
      
      图24. 产后24-26h受精卵200X

溶液配方

1. 0.75%氯化钠
   用称量天平称取0.75 g氯化钠，加少量蒸馏水搅拌溶解后定容至100 ml，常温储存。
2. 70%（80%、90%）无水乙醇
   将量取的70 ml（80 ml、90 ml）无水乙醇加入30 ml（20 ml、10 ml）的超纯水，混匀后常温储存。
   

致谢

本研究得到了国家自然科学基金资助项目（31872341；31572390）、重点科研项目（2017YFE0108000）和江苏省优势学科的资助。

参考文献

1. 蔡中涛.（2006）鸡早期胚胎发育规律和干细胞培养及其转基因的研究. 扬州大学硕士论文.