Mouse Somatic Cell Nuclear Transfer

材料与试剂

1. 10CM培养皿
2. 6CM培养皿
3. 国产玻璃针
4. 毛细管电极（Sutter Instrument Catlog：B100-75-10）
5. 手持式移卵针
6. Mineral oil (Sigma, Catalog:M8410)
7. EmbryoMax® Ultra Pure Water, sterile H2O(Millipore, Catalog:TMS-006-A)
8. NaCl (Sigma, Catalog: S5886)
9. KCl (Sigma, Catalog:P5405)
10. MgSO₄·7H₂O (Sigma, Catalog:M1880)
11. EDTA-Na₂ (Sigma, Catalog:E6635)
12. DL-lactate solution (Sigma, Catalog:L7900)
13. D-(+)-Glucose (Sigma, Catalog:G6152)
14. KH₂PO₄ (Sigma, Catalog:P5655)
15. Poly(vinyl alcohol) (Sigma, Catalog:P8136)
16. Hepes·2Na (Sigma, cat. no. H0763)
17. NaHCO₃ (Sigma, cat. no. S5761)
18. Sodium pyruvate (Sigma, cat. no. P4562)
19. Glutamine (Merck Millipore cat. no. TMS-002-C)
20. Hyaluronidase (Hy; Sigma, cat. no. H3884)
21. Cytochalasin B (CB; Sigma, cat. no. C6762)
22. Polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma, cat. no. PVP360)
23. Phenol red (Sigma, cat. no. P0290)
24. BSA (Sigma, cat. no. A3311)
25. KSOM medium (Merck Millipore, cat. no. MR-106-D)
26. Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; 宁波三生药业)
27. Chorionic Gonadotropin for injection (HCG; 宁波三生药业)
28. 氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司)
29. CZB Stock(1L)（见溶液配方）
30. H-CZB Stock（见溶液配方）
31. Hepes-CZB（见溶液配方）
32. CZB（见溶液配方）
33. CaF-CZB（见溶液配方）
34. CaCl₂·2H₂O (100× stock)（见溶液配方）
35. 2%透明质酸酶溶液(HY)（见溶液配方）
36. SrCl₂·6H₂O(10× stock)（见溶液配方）
37. CB-HCZB（见溶液配方）
38. PVP-HCZB（见溶液配方）
39. 激活液（见溶液配方）
40. TSA-KSOM（见溶液配方）
    

仪器设备

1. (选配)拉针仪
2. (选配)煅针仪
3. 倒置相差显微镜配备4X、10X、20X镜头（完整装置见图A）
   
   
   图A. 显微操作系统
   
   
4. 倒置相差显微镜热台
5. 显微操作系统(ON4-C、IM-12)
6. PIEZO(PMM-150FUMJ)
7. 体式显微镜(SZX7)
8. 体式显微镜热台
9. 酒精灯
10. 桌面式离心机
11. 超声清洗机
12. 细胞培养箱
13. (选配)倒置显微镜荧光部件
14. (选配)倒置显微镜成像部件
    

实验步骤

一、持卵针及去核、注射针的制备：

1. 持卵针：使用程序HEAT：755 PULL：40 VEL：120 TIME：125拉制两根玻璃针。HEAT的温度是根据不同的机器及毛细管电极材质确定的，Sutter InstrumentP-97等型号的拉针仪带有自动检测程序可以测定针的熔点，HEAT温度应接近或高于其熔点，这样才能融化并拉开针，其他三个属性可能需要进行微调，建议参照仪器说明书或咨询工程师。
2. 用砂轮将针断至合适的粗细，确保针的外径约100µm左右，断口处尽量确保平整。
3. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将断口处收紧至15µm左右，一根好的固定针的标准是外径与内径分别是卵母细胞直径的90%和20%。
4. 去核针：使用程序HEAT：760 PULL：40 VEL：120 TIME：120拉制两根玻璃针。
5. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将针在玻璃珠上断至合适的粗细，确保针的内径约8µm左右，断口处要尽量确保平整。
6. 注射针：将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将针在玻璃珠上断至合适的粗细，确保针的内径约5 µm左右，断口处要尽量确保平整。 
7. 如果匹配的显微操作仪需要使用具有一定角度的针，此时将针横向放置，通过在针一侧加热的方式将之弯折至需要的角度，Olympus IX73适配的针一般角度在15度左右。

1. 8周龄左右的F1雌鼠，在取卵前62小时，通过腹腔注射的方式注射5IU PMSG。
2. PMSG注射48小时后，在取卵前14小时，通过腹腔注射方式注射5IU HCG。
3. 在6cm无菌培养皿中使用CZB制作培养碟，每100µl的CZB宜制作6个液滴，每个培养皿应含有30个液滴以上(以便具有足够的新鲜溶液进行充分洗涤)，加完CZB后，使用矿物油封住液面，置于培养箱中平衡。
4. 通过脱颈法（或其他符合动物福利的方法）处死小鼠，收集两侧的输卵管膨大部至Hepes-CZB液滴中，重复操作直至取出全部小鼠的输卵管膨大部，此步骤尽可能在15分钟内完成，如果小鼠数量较多，最好分多批取卵。
5. 在体视显微镜下，用1mL注射器（或其他带有26G针头的注射器）划破输卵管膨大部，释放其中的卵团，用注射器完整挑取卵团至新的100µl Hepes-CZB中去，重复此操作直至转移完所有的卵团。
6. 加入100µl含有HY的Hepes-CZB，37度培养箱消化1分钟，取出用200uL枪头吹打数次，再置入培养箱消化30秒，待卵丘细胞全部从卵母细胞上解离后，从培养箱取出。
7. 迅速将还在消化液中的卵母细胞转移至新鲜的Hepes-CZB中去，在液滴中洗涤数次。
8. 将卵母细胞移至CZB的液滴中，并洗涤数次。
9. 在37度5%二氧化碳培养箱中培养30分钟后进行注射实验。
   
   
   

1. 核移植所用的供体细胞有很多，应当根据不同的细胞选择不同细胞准备方式，下面以卵丘细胞为例。
2. 在实验进行到步骤（2）6时，卵母细胞已经移至不含有HY的液滴后，将同时解离的卵丘细胞用针吸取，在Hepes-CZB中洗涤数次后存放在冰上直至注射。

1. 使用CZB；含有细胞松弛素B以及TSA的含锶激活液；TSA-KSOM；KSOM制作培养液滴，每100 µl的培养液宜制作6个液滴，随后以矿物油封住液面，将所有的培养皿均置于培养箱中平衡。
2. 使用微量上样器从去核针的尾部向针内加入约2-3mm高的汞（有的系统中，使用无毒性的重油替代有毒的汞），将注射针和持卵针安装上显微操作仪，在专用的注射皿或10cm培养皿盖中，制作出数个CB-HCZB小液滴，每100 µl的液体宜制作8个液滴，以及一个PVP液滴，数个PVP-HCZB液滴，并使用矿物油封住液面（完整的装置见图B）。
   
   
   图B.安装完毕的注射系统
   
   
3. 打开热台，在PVP液滴中注射针来回洗吹并施以脉冲将针头洗涤数次，最后在一个CB-HCZB液滴中将针头部分彻底洗至无杂质且来回吹吸顺畅无阻滞感为止。
4. 用手持式移卵针吸取适量的培养在CZB中的卵母细胞，加入到注射皿的CB-HCZB液滴中。
5. 等待数分钟，确保CB-HCZB中的细胞松弛素B发挥作用，阻止Actin的聚合，进而影响卵母细胞的细胞骨架。
6. 将卵母细胞固定在持卵针上，确保卵母细胞的纺锤体在去核针水平方向平行侧（具备相差系统的显微镜，M2时期的小鼠卵母细胞纺锤体与周围卵胞质折光率不同，因此可以肉眼区分，可在固定针近端或远端，下面以远端为例），PIEZO脉冲档调节到合适的程度（使用汞的系统，一般使用强度2，频率1即可），将注射针顶在透明带上，轻踩脉冲，观察透明带是否被打穿，如果没有打穿可以再踩一次或者调高脉冲强度，直至打穿。注意此时一定不能将卵母细胞膜破坏。
7. （可选）轻轻用去核针戳动卵胞质膜，若判断准确，纺锤体相较于周边的卵胞质会呈现出较硬的质地，同时纺锤体是一个整体，会随着针的戳动而移动。
8.  轻轻的用去核针尖端顶住纺锤体，缓缓吸取，可观察到纺锤体被针吸住或直接被吸入去核针内，此时轻轻地向进针反方向拔出去核针，应该能够看到纺锤体连带着附近的一部分卵胞质被吸出或拽出。
9. （可选）去核针打出吸出的物质，如果正确去除了纺锤体，应当能看到打出的物质呈现较硬的棍状，且不会随着时间的推移而有明显变形，如果吸出的物质只含卵胞质，虽然一开始也会因针头的挤压而呈现棍状，但应很快就会变圆。
10. 将去核后的卵母细胞移到另一侧，重复上述操作，直至该组卵母细胞全部注射完毕。
11. 将去核后的卵母细胞移到CZB液滴中洗涤数次。
12. 重复加入另一组卵母细胞，直至所有的卵母细胞都去核完毕。
13. 在最后一组卵母细胞去核完并移到CZB液滴30分钟后，可进行下一步核移植操作。
    
    
    

1. 使用微量上样器从注射针的尾部向针内加入约2-3 mm高的汞（有的系统中，使用无毒性的重油替代有毒的汞），将注射针安装上显微操作仪（上一步实验时的持卵针若已经拆除，此时还需要同时安装上持卵针），在专用的注射皿或10 cm培养皿盖中，制作出数个CB-HCZB小液滴，每100 µl的液体宜制作8个液滴，以及一个PVP液滴，并使用矿物油封住液面。
2. 参考（4）3步骤将注射针清洗干净。
3. 用手持式移卵针吸取适量的培养在CZB中的去核卵母细胞，加入到注射皿的CB-HCZB中，去核卵母细胞应根据操作者的习惯加在注射针的同一侧，这样在注射中可以与注射过的去核卵母细胞加以区分。
4. 将少量卵丘细胞用手持式移卵管加入到PVP-HCZB液滴中。
5. 用注射针吸取卵丘细胞，反复吹打挤压细胞，使其细胞膜破裂，暴露出细胞核，将破碎的卵丘细胞向针内吸取直至视野顶端位置，此时可以再次重复吸取多个卵丘细胞以备后续注射使用。
6. 将针移回加有去核卵母细胞的CB-HCZB液滴中，将去核卵母细胞固定在持卵针上，PIEZO脉冲档调节到合适的程度（使用汞的系统，一般使用强度2，频率1即可），将注射针顶在透明带上，轻踩脉冲，观察透明带是否被打穿，如果没有打穿可以再踩一次或者调高脉冲强度，直至打穿。注意一定不能同时将卵母细胞膜破坏。（若能够找到去核时在透明带上打的洞，也可以跳过这一步直接使用该洞进行注射）
7. 将破碎的卵丘细胞向针尖方向吹至针尖端，插入去核卵母细胞深处（靠近持卵针侧），轻踩脉冲，应观察到破碎的卵丘细胞被打出针头，同时由于脉冲该处的去核卵母细胞膜也会破碎，二者发生融合。
8. 轻轻地按反方向抽出注射针，在即将拔出卵胞质时，用注射针吸取一点带细胞膜的卵胞质，并随着针一起抽出重构卵母细胞，这一步是为了将重构卵母细胞的口封住，由于使用了PIEZO脉冲系统，如果不进行封口会导致卵母细胞破裂。
9. 将重构卵母细胞移到另一侧，重复上述操作，直至该组去核卵母细胞全部注射完毕。
10. 将重构卵母细胞移到CZB液滴中洗涤数次。
11.  重复加入另一组去核卵母细胞，直至所有的去核卵母细胞都注射完毕。（完整的去核以及核移植视频见视频A）
    
    
    
    视频A.卵母细胞去核及体细胞核移植
    
    
12. 在最后一组去核卵母细胞注射完并移到CZB液滴30分钟后，将所有的重构卵母细胞移至激活液液滴中，注意CZB中的钙会显著影响激活液对重构卵母细胞的激活，因此这一步进行充分洗涤尤为重要，尽可能的将残留的CZB洗干净。（激活液中添加CB是为了防止重构胚胎将移入的遗传物质以第二极体的形式排出）
13. 37度5%二氧化碳浓度条件激活胚胎6小时。
14. 将激活后的重构卵母细胞移到TSA-KSOM中，洗涤数次去除残留的激活液。
15. 37度5%二氧化碳浓度条件继续培养胚胎4小时。
16. 将重构卵母细胞清洗数次后移到KSOM中。
17. 37度5%二氧化碳浓度条件培养胚胎直至2细胞形成。

结果与分析

1. 注射完第二天，可以观察到两细胞形成。
2. 在两细胞时期，或者囊胚时期可以进行胚胎移植，进一步获得克隆小鼠，详情请参阅小鼠胚胎移植章节。
   

失败经验

1. 超排效果差，卵母细胞少： 一般超排结果不好是由于很多因素中的一个或者多个同时发生导致的，首先应当检查激素有无问题，然后检查所使用的小鼠，不同品系的小鼠超排的效果很不一样，必要时使用大于8周龄的B6D2F1母鼠进行超排，同时激素注射的时间非常影响结果，需要严格控制给药以及取卵时间窗口。
2. 取卵过程中卵母细胞死亡很多：
   可能是因为操作时间太久了，需要保证卵团消化的时间不要太久，如果初次速度比较慢或卵团比较多，可以分批多次取卵，或在室温进行卵团消化。另外工作浓度的试剂由于不含抗生素成分，需进行分装并保存在4度且尽快用完，过久的试剂可能影响实验效果。
3. 取卵过程中虽然能划出卵团，但很难被针头挑取：
   一般是打药时间不对，HCG注射后14小时即可取卵，但随时间推移，卵团的卵丘细胞会慢慢解离，造成卵团松散无法被挑取。所以即便注射HCG后20小时后仍然可以取到卵母细胞，但卵母细胞整体的质量和数量都会受到影响。
4. 注射时针经常堵：
   如洗不干净可以通过更换注射针解决。堵针最大的原因是因为卵胞质内的物质接触针内部，尤其当其接触到汞柱的时候会导致注射针内壁过于黏而难以清洗干净，在注射时应当避免造成卵母细胞的死亡，因为卵母细胞的死亡伴随着大量的卵胞质的释出，导致周边液体粘稠度变高，但对于初学者，往往又很难避免卵母细胞的死亡，推荐每一组的卵母细胞不要太多，大约10到20颗左右，并且每一组就换一个新鲜的CB-HCZB液滴。
5. 注射完的胚胎经常死：
   一般死在刚注射后的胚胎是因为注射操作造成，尤其是封口操作不熟练导致，熟练提升技术后可以解决。
6. 克隆胚胎状态很差：很多胚胎没有发育到两细胞，或者两细胞的状态不好，一个卵裂球很大一个很小。胚胎状态是由很多因素共同决定的，如果排除培养基的问题以及培养箱温湿度、二氧化碳浓度等硬件上的问题，可能与供体细胞的状态和注射的操作有关，克隆胚胎发育率低于正常的受精胚胎，因此对操作的要求更为严格。
   

溶液配方

1. CZB Stock(1L)
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H2OUp to 1000 mL
   NaCl 4760 mg
   KCl 360 mg
   MgSO₄·7H₂O 290 mg
   EDTA-Na₂ 40 mg
   DL-lactate solution 5.3 ml
   D-(+)-Glucose1000 mg
   KH₂PO₄ 160 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，4度保存。
2. H-CZB Stock
   CZB Stock500 ml
   Poly(vinyl alcohol) 50 mg
   待Poly(vinyl alcohol) 溶解后用0.22 μm滤器过滤除菌，4度保存。
3. Hepes-CZB
   H-CZB Stock98.5 ml
   HEPES476 mg
   NaHCO₃ 42 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   加入100 μl酚红，用盐酸调整pH至7.4，混匀0.22 μm滤器过滤可在4度保存两周
4. CZB
   CZB Stock98.5 ml
   NaHCO₃ 211 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   BSA500 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，可在4度保存两周。
5. CaF-CZB
   CZB Stock98.5 ml
   NaHCO₃ 211 mg
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   BSA500 mg
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H2O(Millipore, Catalog:TMS-006-A)1 ml
   混匀后0.22 µm滤器过滤，可在4度保存两周。
6. CaCl₂·2H₂O (100×stock)
   CaCl₂·2H₂O2500 mg
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H₂O100 ml
7. 2%透明质酸酶溶液(HY)
   透明质酸酶 (Hyaluronidase)200 mg
   Hepes-CZB10 ml
   混匀，100 μl分装，-20度保存，使用时加入900 μl Hepes-CZB
8. SrCl₂·6H₂O(10×stock):
   SrCl₂·6H₂O1.33 g
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H2O(Millipore, Catalog:TMS-006-A)50 ml
   混匀后过滤，可在4度保存至少3个月。
9. CB-HCZB
   Hepes-CZB1 ml
   CB10 μg
10. PVP-HCZB
    Hepes-CZB880 µl
    PVP120 mg
11. 激活液
    SrCl2·6H₂O 10×stock)100 µl
    CaF-CZB900 µl
    TSA5ng
    CB10 µg
    TSA、CB添加量很少，需要提前配置贮存液，并保存在-20度，待使用时解冻加入。
12. TSA-KSOM
    KSOM medium1 ml
    TSA5 ng
    

参考文献

1. Hochedlinger, K. and Jaenisch, R. (2002). Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T donor cells. Nature 415(6875): 1035-1038.
2. Ogura, A., Ogonuki, N., Takano, K. and Inoue, K. (2001). Microinsemination, nuclear transfer, and cytoplasmic transfer: the application of new reproductive engineering techniques to mouse genetics. Mamm Genome 12(11): 803-812.
3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R. and Yanagimachi, R. (1998). Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394(6691): 369-374.
4. Wakayama, T., Rodriguez, I., Perry, A. C., Yanagimachi, R. and Mombaerts, P. (1999). Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 96(26): 14984-14989.
5. Wakayama, T. and Yanagimachi, R. (2001). Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev 58(4): 376-383.