Mouse Intra Cytoplasmic Sperm Injection

材料与试剂

1. 10CM培养皿
2. 6CM培养皿
3. 国产玻璃针
4. 毛细管电极（Sutter Instrument公司，产品目录号：B100-75-10）
5. 手持式移卵针
6. Mineral oil (Sigma公司，产品目录号：M8410)
7. EmbryoMax® Ultra Pure Water, sterile H₂O(Millipore公司，产品目录号：TMS-006-A)
8. NaCl (Sigma公司，产品目录号：S5886)
9. KCl (Sigma公司，产品目录号：P5405)
10. MgSO₄·7H₂O (Sigma公司，产品目录号：M1880)
11. EDTA-Na₂ (Sigma公司，产品目录号：E6635)
12. DL-lactate solution (Sigma公司，产品目录号：L7900)
13. D-(+)-Glucose (Sigma公司，产品目录号：G6152)
14. KH₂PO₄ (Sigma公司，产品目录号：P5655)
15. Poly(vinyl alcohol) (Sigma公司，产品目录号：P8136)
16. Hepes·2Na (Sigma公司，产品目录号：H0763)
17. NaHCO₃ (Sigma公司，产品目录号：S5761)
18. Sodium pyruvate (Sigma公司，产品目录号：P4562)
19. Glutamine (Merck Millipore公司，产品目录号：TMS-002-C)
20. Hyaluronidase简称Hy ( Sigma公司，产品目录号：H3884)
21. Cytochalasin B简称CB (Sigma公司，产品目录号：C6762)
22. Polyvinylpyrrolidone 简称PVP（Sigma公司，产品目录号：PVP360)
23. Phenol red (Sigma公司，产品目录号：P0290)
24. BSA (Sigma公司，产品目录号：A3311)
25. KSOM medium (Merck Millipore公司，产品目录号：MR-106-D)
26. Pregnant mare serum gonadotropin简称PMSG (宁波三生药业)
27. Chorionic Gonadotropin for injection简称HCG (宁波三生药业)
28. 氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司)
29. CZB Stock(1L)（见溶液配方）
30. H-CZB Stock（见溶液配方）
31. Hepes-CZB（见溶液配方）
32. CZB（见溶液配方）
33. CaCl₂·2H₂O(100×stock)（见溶液配方）
34. 2%透明质酸酶溶液(HY)（见溶液配方）
35. CB-HCZB（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 拉针仪（SUTTER INSTRUMENT公司，型号：P-97）
2. 煅针仪（NARISHIGE公司，型号：MF-900）
3. 体式显微镜（NIKON公司，型号：SMZ800N）
4. 倒置显微镜（OLYMPUS公司，型号：IX73）
5. 显微操作系统（品牌：NARISHIGE，型号：IM-9C）
6. 压电式破膜仪PIEZO（EPPENDORF公司，型号：PiezoXpert）
7. 热台（品牌：TOKRI HIT，型号：TPX-SQFT）
8. 离心机（EPPENDORF公司，型号：5430）
9. 超洁净工作台（品牌：万里，型号：SW-CJ-2FX）
10. 二氧化碳恒温培养箱（THERMO公司，型号：i160）
11. 安全柜（THERMO公司，型号：1300 SERIES A2）
12. 倒置相差显微镜配备4X、10X、20X镜头（完整装置见图A）
    
    
    图A. 显微注射系统
    
    
13. 倒置相差显微镜热台
14. 超声清洗机
    

实验步骤

（一）持卵针及注射针的制备

1. 持卵针：使用程序HEAT：755 PULL：40 VEL：120 TIME：125拉制两根玻璃针（HEAT的温度是根据不同的机器及毛细管电极材质确定的，Sutter Instrument P-97等型号的拉针仪带有自动检测程序可以测定针的熔点，HEAT温度应接近或高于其熔点，这样才能融化并拉开针，其他属性的调整请参照仪器说明书或咨询工程师）。
2. 用砂轮将针断至合适的粗细，确保针的外径约100 µm左右，断口处尽量确保平整。
3. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将断口处收紧至15 µm左右，一根好的固定针的标准是外径与内径分别是卵母细胞直径的90%和20%。
4. 如果显微操作仪需要使用一定角度的针，将针横向放置，通过在针一侧加热的方式将之弯折至需要的角度，一般角度在15度左右。
5. 注射针：使用程序HEAT：760 PULL：40 VEL：120 TIME：120拉制两根玻璃针
6. 将针装上煅针仪，调节合适的加热温度，通过加热的方式，将针在玻璃珠上断至合适的粗细，确保针的内径约6 µm左右，断口处要尽量确保平整，尖端可能略有弯折，但不影响使用。
7. 如果显微操作仪需要使用一定角度的针，将针横向放置，通过一侧加热的方式将针弯折至需要的角度，一般角度在15度左右。

1. （取卵前62小时）8周龄左右的F1雌鼠，通过腹腔注射的方式注射5IU PMSG。
2. （取卵前14小时）PMSG注射48小时后，通过腹腔注射方式注射5IU HCG。
3. 在6cm无菌培养皿中使用CZB制作培养碟，，每100ul的CZB宜制作6个液滴，每个培养皿应含有30个液滴以上(以便具有足够的新鲜溶液进行充分洗涤)，加完CZB后，使用矿物油封住液面，置于培养箱中平衡。
4. 通过脱颈法（或其他符合动物福利的方法）处死小鼠，搜集两侧的输卵管膨大部至Hepes-CZB中，重复操作直至取出全部小鼠的输卵管膨大部。
5. 在体视显微镜下，用1 mL注射器划破输卵管膨大部的透明处，释放其中的卵团，用注射器完整挑取卵团至新的100 µl Hepes-CZB中去，重复此操作直至转移完所有的卵团。
6. 加入100 µl 含有HY的Hepes-CZB，37度培养箱消化1分钟，取出用200µL枪头吹打数次，再消化30秒直至卵丘细胞全部解离，立刻取出培养箱。
7. 用手持式持卵针迅速将还在消化液中的卵母细胞转移至新鲜的Hepes-CZB中去，反复洗涤几次。
8. 将卵母细胞移至CZB的液滴中，洗涤次数应当保证溶液已经彻底被替换为CZB。
9. 在37度5%二氧化碳培养箱中培养卵母细胞30分钟后进行注射实验。

1. 性成熟的雄鼠应提前单独放置一周，保证精子数量。
2. 脱颈法（或其他符合动物福利的方法）处死小鼠，将两侧的附睾尾部分离，置于Hepes-CZB中。
3. 用1 mL注射器头划破附睾尾部，此时在体式显微镜下应可以观察到大量的精子游出。
4. 等待5分钟后，将含有精子的Hepes-CZB吸出，如果含有较多的组织块可以通过短暂低速离心去除。
5. 取出的精子一般需要进行分装，单次ICSI实验需要使用的精子数量很少，因此可以进行大幅度的稀释，分装后的精子保存于-80度冰箱可以长期储存，待使用前解冻即可
6. 注射前，使用超声清洗机超声精子10秒，将精子的头与尾部断开。

1. 使用CZB、KSOM制作培养皿，每100ul的培养液宜制作6个液滴，每个6CM培养皿应含有30个液滴以上(以便具有足够的新鲜溶液进行充分洗涤)，加完培养液后，使用矿物油封住液面，两个不同的培养皿均置于培养箱中平衡。
2. 使用微量上样器从注射针的尾部向针内加入约2-3 mm高的汞（有的系统中，使用无毒性的重油替代有毒的汞），将注射针和持卵针安装上显微操作仪，在专用的注射皿或10CM培养皿盖中，制作出数个CB-HCZB小液滴，每100 µl的液体宜制作8个液滴，以及一个PVP液滴，并使用矿物油封住液面（完整的装置见图B）。
   
   
   图B
   
   
3. 打开热台，在PVP液滴中将针头洗涤数次，最后在一个CB-HCZB液滴中将针头部分彻底洗至无杂质且左右吹吸顺畅无阻滞感为止。
4. 用手持式移卵针吸取适量的培养在CZB中的卵母细胞，加入到注射皿的CB-HCZB中，卵母细胞应根据操作者的习惯加在注射针的同一侧，这样在注射中可以与注射过的卵母细胞加以区分。
5. 短暂离心超声过的精子，弃上清，然后重新用适量Hepes-CZB重悬，重悬体积应当根据精子数量而定。
6. 用手持式移卵针吸取少量含有精子的Hepes-CZB，加入到注射皿的CB-HCZB中。
7. 若以上步骤如果完成较快，可以略微等待数分钟，确保CB-HCZB中的细胞松弛素B发挥作用，阻止Actin的聚合，进而影响卵母细胞的细胞骨架。
8. 将卵母细胞固定在持卵针上，确保卵母细胞的纺锤体不在注射侧（通常至于12点或6点钟位置），PIEZO脉冲档调节到合适的程度（使用汞的系统，一般使用强度2，频率1即可），将注射针顶在透明带上，轻踩脉冲，观察透明带是否被打穿，如果没有打穿可以再踩一次或者调高脉冲强度，直至打穿，将透明带残片用注射针吸出弃于一边。注意一定不能同时将卵母细胞膜破坏。
9. 调整视野，用注射针吸取一个精子头部，再次调整视野找到之前打穿的透明带位置，将精子头部置于注射针前端，穿过透明带上的小孔将注射针插入卵胞质中直至靠近持卵针的位置，轻踩脉冲（一般使用汞的系统，使用强度1，频率1即可），应观察到精子头部被脉冲推出注射针头，同时位于针前端的卵母细胞膜会因为受到脉冲破裂。
10. 轻轻地按反方向抽出注射针，在即将拔出卵胞质时，用注射针吸取一点带细胞膜的卵胞质，并随着针一起抽出卵母细胞，这一步是为了将卵母细胞的口封住，由于使用了PIEZO脉冲系统，如果不可以封口会导致卵母细胞破裂。
11. 将注射后的卵母细胞移到另一侧，重复上述操作，直至该组卵母细胞全部注射完毕。
12. 将注射过的卵母细胞移到CZB液滴中洗涤数次。
13. 重复加入另一组卵母细胞，直至所有的卵母细胞都注射完毕。
14. 在最后一组卵母细胞注射完并移到CZB液滴培养30分钟后，将所有的胚胎移至KSOM液滴中，注意胚胎早期发育需要消耗大量培养基中的营养物并代谢出酸性废物，因此每一个液滴中的胚胎数量不宜太多，一般每个液滴不超过20枚胚胎。
15.  37度5%二氧化碳浓度条件培养胚胎直至2细胞形成。
    
    
    
    ​视频：小鼠卵胞质内单精子注射​
    
    

结果与分析

1. 注射完第二天，可以观察到两细胞形成。
2. 在两细胞时期，或者囊胚时期可以进行胚胎移植，进一步获得ICSI小鼠后代，详情请参阅小鼠胚胎移植章节。
   

失败经验

1. 超排效果差，卵母细胞少。
   一般超排结果不好是由于很多因素中的一个或者多个同时发生导致的，首先应当检查激素有无问题，然后检查所使用的小鼠，不同品系的小鼠超排的效果很不一样，推荐使用大于8周龄的B6D2F1 (C57BL/6xDBA/2)母鼠进行超排，同时激素注射的时间非常影响结果，需要严格控制给药以及取卵时间窗口。
2. 取卵过程中卵母细胞死亡很多。
   可能是因为操作时间太久，需要保证卵团消化的时间不要太长，如果初次实验速度比较慢或卵团比较多，可以分批多次取卵，或在室温进行卵团消化。另外工作浓度的试剂由于不含抗生素成分，需进行分装并保存在4摄氏度且尽快用完，过久的试剂可能影响实验效果。
3. 取卵过程中虽然能划出卵团，但很难被针头挑取。
   一般是给药时间不对，HCG注射后14小时即可取到卵，但随时间推移，卵团的卵丘细胞会慢慢解离，造成卵团松散无法被挑取。所以即便注射HCG后20小时后仍然可以取到卵，但卵的质量和数量都可能会受到影响。
4. 注射时针经常堵。
   如洗不干净可以通过更换注射针解决。堵针最大的原因是因为卵胞质内的物质接触针内部，尤其当其接触到汞柱的时候会导致注射针内壁过于黏而难以清洗干净，在注射时应当避免造成卵母细胞的死亡，因为卵母细胞的死亡伴随着大量的卵胞质的释出，导致周边液体粘稠度变高，但对于初学者，往往又很难避免卵母细胞的死亡，推荐每一组的卵母细胞不要太多，大约10到20颗左右，并且每一组换一个新鲜的CB-HCZB液滴。
5. 注射完的胚胎经常死。
   一般刚注射后就死亡的胚胎是因为注射操作造成，尤其是封口操作不熟练导致，熟练提升技术后可以解决。
6. 胚胎状态很差，很多没有到两细胞的，或者两细胞的状态不好，一个卵裂球很大一个很小。
   胚胎状态是很多因素共同决定的，如果排除了培养基的问题、培养箱温湿度、二氧化碳浓度等问题，可能是注射操作对胚胎造成了太大的损伤，这种损伤可能来自于脉冲过强破坏了卵母细胞的遗传物质，或者是因为注射时间过长导致胚胎长时间处在含有细胞松弛素的环境中，甚至可能是油封液面过低导致培养过程中培养基组分蒸发而改变浓度。
   

溶液配方

1. CZB Stock(1L)
   EmbryoMax® Ultra Pure Water, sterile H₂OUp to 1000 mL
   NaCl 4760 mg
   KCl 360 mg
   MgSO₄·7H₂O 290 mg
   EDTA-Na₂ 40 mg
   DL-lactate solution 5.3 ml
   D-(+)-Glucose1000 mg
   KH₂PO₄ 160 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，4度保存。
2. H-CZB Stock
   CZB Stock500 ml
   Poly(vinyl alcohol) 50 mg
   待Poly(vinyl alcohol) 溶解后用0.22 μm滤器过滤除菌，4度保存。
3. Hepes-CZB
   H-CZB Stock98.5 ml
   HEPES476 mg
   NaHCO₃ 42 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   加入100 μl酚红，用盐酸调整pH至7.4，混匀0.22 μm滤器过滤可在4度保存两周
4. CZB
   CZB Stock98.5 ml
   NaHCO₃ 211 mg
   CaCl₂·2H₂O (100×stock)1 ml
   Pyruvate3.0 mg
   Glutamine (200×stock)0.5 ml
   BSA500 mg
   混匀后0.22 μm滤器过滤，可在4度保存两周。
5. CaCl₂·2H₂O (100×stock)
   CaCl₂·2H₂O2500 mg
   EmbryoMax^® Ultra Pure Water, sterile H₂O100 ml
6. 2%透明质酸酶溶液(HY)
   透明质酸酶 (Hyaluronidase)200 mg
   Hepes-CZB10 ml
   混匀，100 μl分装，-20度保存，使用时加入900 μlHepes-CZB
7. CB-HCZB
   Hepes-CZB1 ml
   CB10 μg
   10 μg CB分装储存在EP管中于-20度保存，使用时加入1mL Hepes-CZB混匀。
   

参考文献

1. 1. Kimura, Y. and Yanagimachi, R. (1995). Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 52(4): 709-720.
   2. Ron-El, R., Liu, J., Nagy, Z., Joris, H., Van den Abbeel, E. and Van Steirteghem, A. (1995). Intracytoplasmic sperm injection in the mouse*. Human Reproduction 10(11): 2831-2834.
   3. Yoshida, N. and Perry, A. C. (2007). Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc 2(2): 296-304.