Cryopreservation and Resuscitation of Mouse Embryos

材料与试剂

材料

1. 无菌注射器 （KDL 1ml）
2. 100*20mm 培养皿 （FALCON 353003）
3. 1ML冻存管 (Thermo Nunc CAT NO.377224)
4. 短型玻璃巴斯德吸管(CorningCLS7095B5X-1000EA)

1. PMSG (宁波三生)
2. HCG (宁波三生)
3. FHM (Millipore, MR-025-D)
4. DPBS (Millipore, MR-006-C)
5. DMSO (Sigma, D2650)
6. 食用盐
7. M2 media（millipore, MR-015-D）
8. KSOM AA media（millipore, MR-121-D）
9. DMSO溶液（见溶液配方）

仪器设备

1. 尖嘴系线镊 （协和医疗, MR-F201A）
2. 手术剪 （金钟, JA2405）
3. 200UL移液枪
4. 程序降温仪(planner, Kryo360-1.7)
   

实验步骤

一、受精卵准备

1. 供体准备：供体小鼠腹腔注射PMSG，每只5IU（0.1mL）（第0天）。46-48h后（第2天），腹腔注射HCG，每只5IU（0.1mL）。
2. 注射5-10IUHCG后，将雌鼠与与雄鼠合笼，
3. 次日上午（第3天），检查阴道栓，将见栓小鼠单独分离准备实验。
4. 第5天取2细胞状态的受精卵：脱颈椎法处死雌鼠，取出输卵管，在显微镜下找到喇叭口，用注射器吸取FHM，将注射针头部轻轻插入喇叭口中，用FHM液缓冲 出受精卵，再将受精卵用持卵针收集起来，在培养皿用FHM液体清洗干净。
5. 体外受精所得到的二细胞期的小鼠胚胎也可同样进行后续冻存操作（见体外受精章节）。

1. 在1.5 ml冻存管中,用移液枪装入100 μl DPBS，将受精卵用口吸管移入，将装好受精卵的冻存管置于冰上，静待15分钟。
2. 15分钟后，打开冻存管，加入100 μl DMSO溶液,继续静置在冰上15分钟。
3. 用食盐制出-8 °C至-12 °C的冰①。冰①方法：取适量制冰机制出的雪花冰，放入保温容器中，逐步加入食盐，使其温度下降，直至温度保持在-8℃至-12摄氏度之间。
4. 用食盐制出-20 °C的冰②，冰上放置一个小烧杯，用巴斯德玻璃管虹吸一些DPBS放入烧杯中。冰②制备方法：取适量制冰机制出的雪花冰，放入保温容器中，逐步加入食盐，使其温度下降并保持在-20 °C左右，冰上放置一个小烧杯，用巴斯德玻璃管虹吸一些DPBS放入烧杯中。
5. 将冻存管放置在冰①中两分钟后，打开盖子，用巴斯德管迅速植冰(人工诱导冰晶形成)。
6. 将植冰完成的冻存管迅速放入程序降温仪中缓慢降温至-80 °C后放入液氮贮存。程序降温仪选择2-Cell Freeze Profile: Start temp -12 °C；No seeding selected；#1 hold 05 min 00 seconds；#2 -0.5 °C /min to -80 °C。

1. 在35mm培养皿中用KSOMAA做一些培养滴，根据需要培养液滴大小控制在30-60 μL，用矿物油覆盖，放入培养箱中10分钟。
2. 将冻存管从液氮中取出，放置于室温中等待至其自然融化。
3. 仔细观察，一旦冻存液完全融化, 沿冻存管壁缓慢加入100 μl M2。
4. 等待2分钟后，沿管壁再次缓慢加入100 μl M2。.
5. 等待2分钟后，沿管壁再次缓慢加入100 μl M2。.
6. 再次等待 2 分钟后，用 1ml 移液枪将冻存管里的液体连同胚胎一起转移至一个皿中，在解剖镜下捡出胚胎，再将胚胎转移到提前准备好的 60 mm 培养皿中（提前已经制备了6滴M2），用干净的M2清洗6次。
7. 将清洗后的胚胎转移到事先准备好的35mm培养皿中，放入37 °C培养箱中，十分钟后，将颜色发暗、透明度差、立体感不明显的胚胎淘汰，挑出清亮、立体感强的存活胚胎，移植入孕0.5天的受体雌鼠输卵管中。
   
   
   图1. 正常胚胎与异形胚胎

结果与分析

1. 本实验室的胚胎复苏率通常在72%-95%的范围内，平均复苏率约85%。
2. 程序冷冻法主要使用渗透较慢的低温保护剂二甲基亚砜(DMSO)，使冷冻保护剂充分渗透人胚胎细胞内，平衡后，利用程序降温仪缓慢降温，最后投入液氮保存。程序冷冻法虽然操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，但由于采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高；在储存和运输时，对于环境温度的变化有更大的耐受力。
3. 通过冷冻保存小鼠胚胎的方法，可以防止由于各种原因造成的有价值品系和稀有突变体的丢失，预防繁育过程中的遗传漂变和遗传污染防止疾病的传播，并可以进行快速而廉价的基因修饰小鼠的运输
   

溶液配方

1. DMSO溶液
   8.6 ml DPBS + 1.4 ml DMSO
   

致谢

本实验室的胚胎操作技术主要来源于中科院分子细胞中心李劲松研究员实验室，美国洛克菲勒大学转基因平台及美国洛克菲勒大学Peter Mombaerts实验室。特此致谢！

参考文献

1. Andras, N., Marina, G., Kristina, V. and Richard, B.(2003). Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.