Cryopreservation and Resuscitation of Mouse Sperm

材料与试剂

材料

1. 培养皿35 mm×10 mm（Corning，货号：430588）
2. 0.25 mL麦管（IMV，货号：005565）
3. 三角盒（Minitube，货号：16981/01361）
4. 硅胶管、塑胶管、硅胶帽（Drummond，货号：D2-000-000）
5. 针式过滤器（Millex-GP，货号：SLGP033RB）
6. 吸头（Axygen，货号：T-300-R-S、T-1000-B-R-S、T-200-Y-R-S）
7. 50 mL离心管（BD，货号：352070）
8. 1.5 mL离心管（上海生物工程，货号：F601620-0010）
9. 无菌注射器（上海米沙瓦医科工业有限公司，规格：50 mL、20 mL、1 mL）
10. 100 mL烧杯（蜀牛，货号：GG-17）
11. 100 mL容量瓶（天玻，货号：TB9）
12. 滤纸（宝威德 ，规格：60×60cm）
13. 标签（自制）
14.  记号笔（得力，货号：6881）

动物：3-6月龄健康雄性动物2-3只，需交配过，于冻精前一周取出雌鼠后单独饲养。所用动物来自杭州师范大学实验动物中心。生产许可证号：SCXK（浙）2016-0004，使用许可证号：SYXK（浙）2016-0014。饲养在独立换气笼盒系统，动物自由饮水、自由采食Co⁶⁰辐射的灭菌饲料。

主要试剂：

1. CPA（表1）
2. mHTF (modified human tubal fluid)（表2）
3. 矿物油（Sigma，货号：M8410-1L）
4. 液氮（杭州今工特种气体有限公司，规格：99.999%）

仪器设备

1. 生物安全柜（ThermoScientific，型号：1384）
2. 超净工作台（苏净安泰，型号：HS-840-U）
3. 液氮罐（Thermo Scientific，型号：8210）
4. 恒温加热台（深圳鑫诚，型号：JR-100）
5. 体视显微镜（Nikon，型号：SMZ745T）
6. 倒置显微镜（Nikon，型号：1500）
7. 离心机（eppendorf，型号：5418）
8. 电子天平（Sartorius, 型号：MSA125P-CE）
9. 封口机（Fuji Impulse, 产品型号：P-200）
10. 涡旋仪（IKA，型号：Vortex1）
11. 微量移液器（eppendorf，货号：3120000224、3120000240）
12. 手术剪（上海金钟，型号：J21010）
13. 医用镊（上海金钟，型号：J40120）
14. 维纳斯剪（上海金钟，型号：YC0040）
15. 显微镊（上海金钟，型号：WA3030）
16. 眼科直剪（上海金钟，型号：Y00030）
17. 眼科直镊（上海金钟，型号：JD1050）

实验步骤

一、准备工作

1. 预冷管制作（如图1-A），50 mL注射器取出栓塞，在腔内塞入泡沫板，热封底部开口，再将其固定在塑料杆上，放在液氮表面漂浮备用。
2. 精子悬液吸取装置（如图1-B），使用硅胶管将1 mL注射器与塑胶管连接，硅胶帽置于塑胶管口，再将麦管装入硅胶帽中。
3. 冻存滴制作，用CPA冻存液在培养皿内先做一个60 µL液滴，加3-4 mL矿物油覆盖，再吸取60 µL的CPA冻存液加入到刚做的液滴中，最终做成一个高的、半球样120 µL液滴。
4. 麦管及三角盒（如图1-C），标注动物品系名称、编号等，三角盒置于预冷管中预冷。
   
   
   图1. 精子冷冻流程. A. 自制预冷管 B. 自制精子悬液吸取装置 C. 装有麦管的三角盒 D. 附睾的解剖位置 E.附睾剪切位置，白色箭头标注为切口位置 F. 麦管吸取精子悬浮液 

二、精子冻存操作流程

1. 打开生物安全柜，准备手术剪、医用镊、眼科直镊、眼科直剪等。紫外灯消毒15 min。
2. 小鼠脱颈椎处死，酒精消毒，打开腹腔，取出附睾尾（如图1-D），去除脂肪并在滤纸上吸干血渍。
3. 将附睾尾放入CPA滴中，显微镜下用维纳斯剪纵向4-5刀，剪开附睾尾（如图1-E）。
4. 把含有精液的培养皿放在37 ℃热台上孵育3 min，每分钟轻轻混匀1次，有助于精子的扩散。
5. 在等待孵育过程中，用精子悬液吸取装置小心吸取100 µL的mHTF和10 mm的空气到麦管中备用（10支麦管/只小鼠）。
6. 沿扩散均匀的精液滴外围，用移液器慢慢地吸取10 µL做一个液滴，重复操作，每只小鼠做10个滴。
7. 用准备好的麦管吸入10 µL精液和10 mm空气（如图1-F），取下麦管，在封口机上小心密封两端开口。重复上述操作。
8. 将密封好的10支麦管放入已预冷的三角盒内，预冷10 min。
9. 预冷10 min后，将预冷管快速浸入液氮。同时将三角盒转入液氮桶内长期保存。
10. 重复上述操作，一般每个品系冻存20-30支麦管（即2-3只小鼠）。
11. 验证精子冻存情况，可吸取CPA液滴中的精液1 µL到100 µL的mHTF滴中，矿物油覆盖，在CO₂培养箱10 min，镜下观察精子活力。或者次日随机取1支麦管做复苏验证，查看并记录精子活力和体外受精率。

三、冷冻精子的复苏及获能（见体外受精章节）
从液氮内取出冻存麦管，在空气中停留5 s，快速放入37 ℃的水浴锅中，孵育10 min。取出麦管擦干，麦管上端密封口和mHTF液之间剪开，用食指密封固定麦管一端，同时在另一端密封口位置剪开麦管，慢慢释放精液至TYH with MβCD滴中（勿将上端的mHTF放入），再将其放入培养箱（37 ℃、5%CO₂）孵育50-60 min获能。

溶液配方

1. CPA配制表
   
   表1：CPA配制表（20 mL体积）
   

   名称	重量（mg）	品牌	货号
   Raffinose pentahydrate	3600	Sigma	R-7630
   Skim milk	600	Difco	232100
   L-glutamine	292	Sigma	G-8540

   
   配制方法：将上述药品加入含有20 mL灭菌水（Sigma, W1503）的50 mL离心管内，封口膜密封，放置在60 ℃水浴锅孵育90 min，每30min用涡旋仪震荡3 min。再按1.0 mL等量分装在1.5 mL离心管内，10,000 x g离心60min。取上清液收集在50 ml离心管中，上清液经0.22 µM针式过滤器过滤，分装在1.5 mL的离心管内。4 ℃保存，有效期30天。
   
   
2.  mHTF配制表
   
   表2：mHTF配制表（100 mL体积）
   

   名称	重量（mg）	品牌	货号
   NaCl	593.8	Sigma	S-5886
   KCl	35.0	Sigma	P-5405
   CaCl2	57.0	Sigma	G-5670
   Glucose	50.0	Sigma	G-6152
   MgSO4	2.4	Sigma	M2643
   KH2PO4	5.4	Sigma	P-5655
   Sodium pyruvate	3.5	Sigma	P-4562
   60%sodium lacate	0.34mL	Sigma	L-7900
   NaHCO3	210.0	Sigma	S-5761
   Penicillin G	7.5	BD	C15935000
   Streptomycin	5.0	Sigma	S-1277
   Bovine serum albumin	400.0	Sigma	B2064
   0.5%phenol red	0.04ml	Sigma	P-0290

   
   配制方法：在100 mL的烧杯中，加入80 mL的灭菌水（Sigma, W1503），将上述药品依次加入混匀，容量瓶定容至100 mL。0.22 µM针式过滤器过滤分装在1.5 mL的离心管内。4 ℃保存可用30天。
   

经验体会

1. 雄鼠的选择，应使用健康、年龄在3-6月龄的动物，冻精前一周合笼后分笼饲养，精子质量较好，冻存后复苏率可在80%以上。年龄小于3月龄或者大于8月龄的雄鼠，未合笼饲养或者长期合笼的雄鼠，营养不良、精神状态不好的雄鼠，精液质量欠佳，冻存后复苏率在40-70%，个别品系及个体出现过30%以下的复苏率。
2. 冻存滴制作，分两步完成，尽量做成一个高的、半球样的液滴，这样精子更均匀分散，同时在收集精液时减少浪费。
3. 附睾采集时，尽量去除多余的脂肪组织，可用滤纸吸干多余的液体。
4. 镜下剪开附睾时，纵向4-5刀，尽量减少破碎的组织，以免混杂在精液内，影响冻存质量。
5. 麦管密封时，需要利用注射器慢慢推注一下，检查麦管是否完全密封。
6. 麦管三角盒标记需要清晰可辨，存放位置可查，同时做好记录，以备复苏时查询。
7. CPA配置过程中，上清液吸取过程容易吸入下层浑浊液体，应尽可能只吸取上清液，若有浑浊液体，建议再重复离心操作.
8. CPA冷藏保存，有时会出现结晶，不建议使用。EP管保存使用有效期为一个月，安瓿瓶使用有效期3-6个月。
   

致谢

本实验方法源自日本熊本大学动物资源与开发中心。撰稿人顾美儿曾经得到Naomi Nakagata教授和Toru Takeo博士的大力帮助，尤其在实验技术要点及操作细节方面得到悉心指导，杭州师范大学实验动物中心及中科院分子细胞中心动物实验技术平台及在多年实践中全面掌握并成功应用了此技术方法。

参考文献

1. Takeo, T. and Nakagata, N. (2011). Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed C57BL/6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod 85(5): 1066-1072.
2. Takeo, T., Sztein, J. and Nakagata, N. (2019). The CARD Method for Mouse Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization Using Frozen-Thawed Sperm. Methods Mol Biol 1874: 243-256.