Inducing Superovulation and Isolation of Mouse Oocytes

材料与试剂

材料

1. 培养皿 ：35 mm、60 mm、100 mm（Corning，货号：353001、353002、353003）
2. 胚胎移植口吸管（北京吉田生物科技有限公司，规格：1.0*500 mm）
3. 移液枪头（Axygen，货号：T-300-R-S、T-1000-B-R-S、T-200-Y-R-S）
4. 无菌注射器（上海米沙瓦医科工业有限公司，规格：1 mL）
5. 移液管（10 ml，corning 货号：CLS4488-200EA）
6. 离心管（1.5ml，Axygen 货号：MCT-150-C）

动物：提前一周从供应商订购供体雌鼠（动物周龄参考表1），并饲养在独立换气系统笼盒内，动物自由饮水、自由采食经Co⁶⁰辐射的灭菌饲料。

试剂

1. 生理盐水（0.9%氯化钠注射液）
2. 孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素（HCG） (生产商：宁波三生生物科技有限公司）
3. 75%消毒酒精
4. FHM胚胎操作液（EmbryoMax FHM HEPES Buffered Medium）（Milipore 货号：MR-025-D）
5. 透明质酸酶（HY）（SIGMA 货号：H3506）
6. KSOM胚胎操作液（KSOM Mouse Embryo Media）（Milipore 货号：MR-121-D）
7. PMSG（见溶液配方）
8. HCG（见溶液配方）

仪器设备

1. 烧杯（50 mL，蜀牛，货号：GG-17）
2. 移液枪（200 μl，eppenddorf）
3. 超净工作台（万里，型号：SW-CJ-2FX）
4. CO₂培养箱（THERMO，型号：i160）
5. 体视显微镜（Nikon，货号：SMZ800）
6. 手术剪（上海金钟，J21010）
7. 医用镊（上海金钟，J40120）
8. 眼科剪（上海金钟，Y00030）
9. 眼科直镊（上海金钟，JD1050）
   

实验步骤

一、诱导超数排卵

1. PMSG和HCG试剂配制（方法见溶液配方）。
2. 取一只无菌注射器，吸入PMSG稀释液，抓取供体小鼠单手保定，腹腔注射PMSG，目的是模仿内源性促卵泡素的作用，促进卵成熟，剂量：每只5IU（0.1 mL）。
3. 注射PMSG 46-48 h后，腹腔注射HCG稀释液（方法同上），用人绒毛膜促性腺激素模仿促黄体素的诱导排卵作用，剂量：每只5IU（0.1 mL）。
4. 雌鼠的性成熟度是影响超排卵数的主要因素。不同背景的小鼠超排最佳年龄也有所不同，请参照下表:
   
   不同品系小鼠最佳超排年龄和排卵数量
   

   品系	超排年龄及重量	超排数量（枚)
   c57	3-4w（8-12g）	40±10
   ICR	3-6w（17-30g）	20±10
   DBA	8-10w	20±10
   BALB/C	8-10w(20-27g)	15±5
   FVB	8-10w	20±5
   S129	8-10w	35±5
   C3H	8-10w	18±5
   SWISS Webster	8-10w	30±5

   
   

1. 卵母细胞采集的时间通常在小鼠注射hCG后13-16小时内进行。
2. 打开超净工作台，准备手术剪、医用镊、眼科直镊、眼科剪等（预先经过提前高压灭菌处理或者用75%的酒精浸泡），紫外灯消毒15 min。
3. 打开体视显微镜，准备卵母细胞培养滴：用200 μl的移液枪取KSOM试剂，在60 mm培养皿内做若干水滴状的滴, 并用矿物油覆盖，放入培养箱（37 ℃、5%CO₂）预热至少10 min。
   
   
   图1. 培养滴及覆盖了石蜡油的培养皿
   
   
4. 准备组织收集滴：取出35 mm培养皿，加入1 ml FHM体外操作液。
5. 小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精消毒腹部，打开腹腔取出输卵管，将其放入 FHM 组织收集滴内。
6. 在体式显微镜下观察到输卵管的上部（壶腹部）有一个明显的膨大处。用镊子固定输卵管，用一根1 ml注射针纵向撕开壶腹部，用此法将其整个撕裂，卵团会游离到液体中，如果卵团不能自己释出，可以用镊子轻轻地把它们挤出来。
   
   
   图2. 输卵管及卵团（B镊尖处）
   
   
7. 去除卵丘细胞：取一个100 mm的培养皿盖，并在上面做8个100 µl的FHM滴，用200 μl的移液枪将卵团收集到其中一个滴内，加入同体积的透明质酸酶（HY，0.3 mg/ml）,可用移液枪轻轻吹打几下，放入CO₂培养箱中，1分钟后取出，在体视显微镜下观察卵母细胞已经分散开来，用移卵管收集卵母细胞到另外一个滴里，并用剩下的6个滴逐步清洗，完成后转移到事先准备好的KSOM滴中，放回37 ℃ CO₂培养箱中备用。
   
   
   图3. 卵母细胞的处理过程（C为处理好的卵母细胞）
   

溶液配方

1. PMSG
   移液器移取20 ml的0.9%氯化钠注射液于50 ml烧杯中，用200 µl移液枪将PMSG冻干粉末反复多次溶于其中，并混匀。浓度为50 IU/ml。用1ml注射器根据实验需要的量分装到1.5 ml离心管中，封口膜封口，标注好名称及配制时间，置于-20 ℃冰箱，可保存一个月。
2. HCG:同上述方法配置。
   

致谢

本实验室的胚胎操作技术主要来源于中科院分子细胞中心李劲松研究员实验室，美国洛克菲勒大学转基因平台及美国洛克菲勒大学Peter Mombaerts实验室。特此致谢！

参考文献

1. Andras, N., Marina, G., Kristina, V. and Richard, B.(2003). Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.