Sperm Cryopreservation in Zebrafish

材料与试剂

1. 10 μL一次性吸头（Axygen, catalog number: T300）
2. 200 μL一次性吸头（Axygen, catalog number: T200）
3. 10厘米毛细玻璃管（Drummond Scientific Company, catalog number: 2-000-010） 
4. 超低温冻存管（Thermo, catalog number: 3744WHI）
5. 超低温标签纸（Brady Worldwide, catalog number: B-8423）
6. 15毫升离心管（Falcon, catalog number: 352099）
7. 防冻手套（3M Thinsulate）
8. 35 mm塑料平皿（海门，货号：HC027）
9. 木锤（Harden, catalog number: 59415 450G）
10. 大泡沫盒，用于盛放干冰，深度大于15厘米
11. 小泡沫盒，用于盛放液氮
12. 海绵鱼托（自制，用于固定雄鱼位置，附图1）
13. 塑料勺子（边缘光滑）
14. 医用细轴吸水棉签
15. 性成熟雄性斑马鱼
16. Tricaine（Sigma, catalog number: E10521），4 °C短期储存，-20 °C长期储存
17. NaCl（Sigma-Aldrich, catalog number: 746398）
18. KCl（Sigma-Aldrich, catalog number: 746436）
19. CaCl₂（Sigma-Aldrich, catalog number: 793639）
20. NaHCO₃（Sigma-Aldrich, catalog number: 792519）
21. 脱脂奶粉（Organic Valley/Organic Nonfat Dry Milk/non-instant. grade A）
22. Methanol（Sigma-Aldrich, catalog number: 34860-1L-R）
23. 干冰（粉末状）
24. 液氮
25. 麻醉剂Tricaine储液（见溶液配方）
26. 10x Ginsburg Fish Ringers（GFR）溶液（不含NaHCO₃）（见溶液配方）
27. 10x NaHCO₃（见溶液配方）
28. 1x GFR溶液（见溶液配方）
29. 不含甲醇（Methanol）的冻存液（见溶液配方）
30. 含甲醇的冻存液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 250 mL 烧杯（Bomex, catalog number: 20201-250）
2. 微量移液器（Drummond, catalog number: 3-000-752）
3. 无菌过滤器接收瓶（Thermo, catalog number: 455-0150）
4. 0.5-10 μL移液器（Eppendorf Research plus, catalog number: 3120000020）
5. 2-20 μL移液器（Eppendorf Research plus, catalog number: 3120000291）
6. 20-200 μL移液器（Eppendorf Research plus, catalog number: 3120000054）
7. 宽头镊子（Vetus, catalog number: 33A-SA）
8. 配种缸（上海海圣，型号：HS022）
9. 体视显微镜（Olympus, model: SZ2-LGB）
10. 鹅颈灯（Olympus, model: LG-PS2）
11. 液氮罐（Thermo Scientific, model: Locator 4 plus）
12. 静音混合器（Qilinbeier, model: WH-986）
13. 标签打印机（Zebra, model: GT820TM）
    

实验步骤

斑马鱼是一种热带淡水鱼类，成年鱼体长3至5厘米，其精巢呈白色长条索状，以成对的形式附着于腹腔的背侧（Gupta and Mullins, 2010）。斑马鱼精巢在分类上属于叶状型，由许多小叶组成，小叶中有多个包含精原细胞的生精小囊，精子成熟过程中，一个生精小囊中的所有生殖细胞基本上处于同一个发育阶段，通过挤压腹部可以将精子从输精管中挤出体外，大部分的精子可以通过这种方式收集到。斑马鱼精子的冷冻保存研究始于1982年，Harvey et al使用以甲醇作为抗冻剂的Ginsberg Fish Ringers（GFR）保护液，冷冻保存斑马鱼精液，获得最佳51%的受精率（Harvey, 1982）。21世纪，有多家实验室对斑马鱼精子冻存技术进行过探索，Morris et al使用二甲基甲酰胺（DMA）作为抗冻剂，获得平均14%的复苏率，Yang et al以甲醇作为抗冻剂，获得33%的复苏率（IV, 2003; Yang et al., 2007）。2009年，Moens et al在Harvey Method的基础上进行了优化，使之易于操作且适于大批量冻存（Carmichael et al., 2009; Draper and Moens, 2009）。国家斑马鱼资源中心现在使用的超低温精子冻存方法，是以Moens-Draper protocol为基础，适应本地化的操作流程，操作更容易上手，冻存效率上也略胜一筹。通过精子的冷冻保存，可以节省养殖空间，以及与之相应的人力物力资源，并为鱼类遗传育种和生物技术研究不间断地提供研究材料，大大方便了遗传发育研究。

1.  准备工作
   1. 本实验步骤较繁复，所需工具较多，实验的准备工作对冻存精子样品的最终质量影响很大，建议由至少2人合作完成准备工作和后续实验过程。全部所需材料工具都在图1中做出详细说明。
   2. 雄鱼准备：在实验开始前一天的下午，将准备用于精子冻存实验的斑马鱼雄鱼从养殖系统转移到配种缸中过夜，并做好品系标记（图1A）。实验前一天的下午开始不再喂食，饥饿过夜可以让雄鱼适当的清空肠道，方便后续的实验。每次实验需要额外准备适量（5-10尾）野生型雄鱼，从中取样作为本次实验的对照组样品，监控冻存实验质量。
   3. 溶液准备：精子冻存液和麻醉剂要求现用现配，应于实验当天一早准备。首先配制10x NaHCO₃溶液，再配制1x GFR溶液，最后根据冻存液配方分别配制不含甲醇和含甲醇的冻存液，前者是用于取样不足量精子样品时体积的补平，后者是真正的冻存保护液。冻存液配好后需要充分混匀，建议使用混合器混合20至30分钟。
   4. 标签准备：提前打印或手写好超低温标签，一个样品可冻存两管拷贝，因此每个品系需要打印或手写至少2个标签。
   5. 干冰准备：实验前一天预订干冰，最好能预订实验当天早晨现做的粉末状干冰，或在实验前自行粉碎干冰为粉末状，尽可能粉碎均匀，以确保实验过程中的样品降温过程冷却均匀。实验当天早上把粉末状干冰移到一个大小合适的泡沫箱中，微微压实，保证内部没有结块的干冰或较大的空隙。干冰的深度应大于15厘米（比15 mL 离心管略高），因为装有精子样品的冻存管将放入15 mL 离心管中，深埋入干冰降温。为了方便后续实验的进行，可使用木锤在干冰中预先敲出30至40个15 mL 离心管样的管道。不可以使用颗粒状的干冰或者已板结成块的干冰。
   6. 毛细玻璃管准备：提前标记好毛细玻璃管，在距离毛细玻璃管底端1.67 cm（3.3 μL）处使用记号笔做上标记（图2A）。
      
      
      图1. 斑马鱼精子冻存准备及操作示意图. A. 麻醉工作台，1. 依序摆放的待冻存鱼系；2. 依序麻醉中的鱼系；3. 海绵鱼托；4. 吸水纸；5. 捞鱼用勺子；6. 棉签；B. 精子样品收集及预处理工作台，7. 鹅颈灯；8. 解剖显微镜；9. 麻醉并固定好的雄鱼；10. 宽头镊子；11. 贴好标签并拧开盖子的冻存管；12. 1.5 mL 离心管分装的含甲醇的冻存液；13. Drummond微量移液器；14. 35 mm无菌平皿；15. 0.5-10 μL移液器；16. 2-20 μL移液器；17. 20-200 μL移液器；18. 不含甲醇的冻存液；19.含甲醇的冻存液；20. 作好3.3 μL 标记的毛细玻璃管；C. 慢速降温及记录工作台，21. 标记好的15 mL离心管；22. 打印好的标签；23. 计时器；24. 冻存记录本；D. 麻醉好的雄鱼，身体侧翻，腮盖活动停止 ；E. 35 mm无菌平皿，25. 用于精子样品补齐的不含甲醇的冻存液；26. 16.7 μL含甲醇的冻存液； F. 分装好精子样品的冻存管放入15 mL 离心管中；G. 预留好15 mL 离心管管道的干冰盒，27. 慢速降温中的样品；28. 木锤；H. 液氮速冻盒，样品以两个平行备份的形式分别依序摆放，液氮液面应超过样品，29. 速冻中的精子样品。
      
      
      
2. 精子冻存实验
   1. 雄鱼麻醉：使用烧杯配制新鲜的麻醉剂，可以准备3-4个烧杯，每个烧杯装入100 mL左右的麻醉剂。捞取斑马鱼雄鱼，适当控去多余水分，移入麻醉剂中，并做好品系标记，等待30秒左右，观察雄鱼鳃盖活动频次，直至腮动停止，鱼身失去平衡，侧面躺倒在水中则已进入深度麻醉状态（图1D）。对于经验丰富的操作者，单次麻醉的雄鱼尾数不超过10尾，初学者则不超过5尾，以防麻醉时间过长致鱼死亡。将已经充分麻醉的雄鱼用勺子捞出，放在吸水纸上，用勺子将鱼身翻一次，每一面1至2秒钟，吸掉鱼身上的水分，不要过分干燥以免损伤鱼鳞给鱼造成不可逆转的伤害（图2B），将吸干水分的雄鱼放置在自制海绵鱼托上，腹部朝上，固定住鱼头，用细轴吸水棉签分开腹鳍，露出泄殖孔，并将泄殖孔附近的水分进一步吸干（图2C）。海绵鱼托在使用前用麻醉剂适当润湿，避免接触面太干损伤鱼鳞。
   2. 精子样品收集：使用宽头镊子轻轻挤压鱼腹，精子样品由泄殖孔流出，迅速利用毛细玻璃管的虹吸作用收集精子样品。为了避免操作者体温对收集精液的不良影响，请尽量使用宽头镊子挤压鱼腹收集精液，避免直接上手操作，此外在拿取毛细玻璃管时，尽量不触碰收集精液的那一端，手持的位置一般在毛细玻璃管的中上部或另一端。品质上乘的雄鱼1尾可收集到满足3.3 μL的精子样品，品质一般的雄鱼可收集1 μL左右样品。精子样品的质地以白色乳状液体为佳（图2D），如呈透明水状则说明样品质量差。一个冻存精子样品可能需要收集1到多尾同品系雄鱼的精子样品，样品总体积至少要达到1 μL才可操作冻存。操作需控制好时间，一个品系的精子样品收集尽量在1分钟内完成。宽头镊子使用前适当润湿，挤压鱼腹时的动作应尽量轻柔，避免用力过度，收集完精子样品的雄鱼迅速转移到复苏缸中苏醒。使用毛细玻璃管收集精子样品，比较快捷，不易引入气泡，同时由于毛细玻璃管管径粗细一致，有助于精子样品体积的估算。操作手法应当轻挤慢吸，避免精子样品流出过快，造成浪费。
   3. 精子样品预处理：对于每个冻存的品系，在一个35 mm塑料无菌平皿的边缘加入一大滴（约50-100 μL）不含甲醇的冻存液。如果收集到的精子样品不足3.3 μL，使用不含甲醇的冻存液补平至3.3 μL。如收集的精子样品已满足3.3 μL，则直接进行后面的操作。在平皿的干净平面中迅速加入一滴16.7 μL含甲醇的冻存液（图1E），将毛细玻璃管插入到微量移液器的吸嘴端，利用微量移液器将收集到的足量的或补平的3.3 μL精子样品轻轻加入到液滴中（精子样品体积：含甲醇的冻存液体积≈1:5），总体积 20 μL，轻轻吹打混匀，尽量避免引入过多的气泡，以减少溶液的损失。此处推荐在平皿表面进行混合处理，因为操作液体的体积较小，在平皿表面易于观察和操作，方便混合步骤快速完成。
   4. 精子样品分装及慢速降温：提前在冻存管上贴上做好品系标记的超低温标签，将混匀的精子样品迅速分装到2个冻存管中，每管10 μL，盖紧后迅速放入15 mL 离心管中，再埋入干冰中慢速降温20 分钟（可以使用木锤将样品敲入干冰，确保15mL离心管整个埋入干冰中并受热均匀）。每个15mL管仅放入1个冻存管，保证冻存管落入离心管的底部。操作需要熟练迅速，注意控制时间，精子样品从加入冻存保护液到放入干冰中时间尽量不要超过60秒。慢速降温时间需严格为20分钟，为了试验中不发生错误，应当对操作时间做好记录：第一个样品放入干冰中记录为0：00，则取出时间记录为20：00，依此类推，每一个样品都需记录好放入干冰和取出干冰的时间（图1C）。
   5. 精子样品速冻：精子样品在干冰中放足20分钟后取出，将装有精子样品的冻存管迅速倒入液氮中速冻，避免回温，并依序摆放到冻存盒中（图1H）。短暂存放样品的泡沫盒内液氮液面应超过样品，如实验过程较长，中间需要及时补充液氮，保证液位。
      
      
      图2. 斑马鱼精子样品收集操作示意图. A. 标记好的毛细玻璃管，红色箭头处标记的是3.3 μL；B. 麻醉好的雄鱼使用吸水纸吸干多余水分; C. 将雄鱼固定在海绵鱼托上，腹部朝上；D. 使用宽头镊子轻轻挤压鱼腹收集精子样品，优质的精子样品呈乳白状，红色箭头标示的是泄殖孔。
      
      
      
3. 冻存精子库的维护
   1. 精子冻存实验完成后，将在液氮中速冻好的精子样品移入液氮罐中长期保存。根据冻存库记录定期整理冻存品系的精子样品，有序摆放。
   2. 定期（每次冻存实验后、每个月或每季度）复苏少量的精子样品，通过持续跟踪冻存精子的复苏受精率来监控冻存环境和样品的稳定性。
   3. 液氮储藏设备需要及时补充液氮，以保证其稳定运行，这一点在精子样品的长期保存过程中尤为重要。确保每次操作过程或保存过程中，样品的回温不能高于-120 °C。液氮储藏设备的体积不能太小，小于100 L的冻存罐受外界室温影响大，不利于超低温环境的稳定。如果冻存实验和保藏过程得当，精子样品在液氮中可保存十年以上依然有受精活力。

结果与分析

精子冻存效果的评估方法有很多种，可以通过镜检冻存精子复苏后的活力来评定，也可以通过复苏受精实验来评估。以后者为例，平均复苏受精率在25%及以上，就可以认为精子冻存实验是成功的。国家斑马鱼资源中心的精子冻存库始建于2015年，库容超万支，最早的精子样品已冻存超过7年，定期的质量监控显示，无论是以冻存操作时间还是以样品在库储藏时间为统计口径，精子库的平均复苏受精率均为53%左右，最佳超过90%（图3）。


图3. 国家斑马鱼资源中心精子冻存库复苏受精率统计. X轴为在库储存时间（M：月），Y轴为冻存精子复苏受精率；数据为2015年至2021年，样品最长在库时间84个月。每个点代表一个样品复苏受精率的数据点，红色折线为数据的平均值。随着精子样品冻存时间的增加，整体复苏效率保持平稳，平均为53%左右。

失败经验

精子冻存实验中使用的精子样品质量、冻存试剂，精子样品预处理和慢速降温过程的控制，都有可能影响后期复苏后受精效果。

1. 精子样品质量不佳有如下可能的原因
   1. 用于精子冻存实验的雄鱼的年龄、营养状况、养殖环境和品系背景等均对精子质量有一定的影响。斑马鱼的性成熟周期是三个月。3月龄的斑马鱼雄鱼可以用于自然交配产卵，但是产精体积过少，不适于收集精子样品。18个月龄之后，斑马鱼逐渐进入老年期，精子样品产量和质量都会下降，也不适于收集样品。因此尽量使用年轻（6至18月龄）的雄鱼，在实验前一个月左右加食喂养，有助于提高精子样品质量。斑马鱼的养殖条件对精子样品的质量和产量都有很大影响。用于精子样品收集的雄鱼应当与雌鱼有自然交配经历，且交配成功产卵。冻存前一月，用于操作的雄鱼可单独分缸养殖，不再接触雌鱼。养殖密度不宜过高。保证每天至少2次活饵料投喂。长期投喂不足，冻存操作前进行过自然交配，或刚刚接受过剪尾鳍损伤的雄鱼，精子样品的产量和质量都会受到影响，甚至收集不到。
   2. 斑马鱼精子样品收集的方法有2种，活体挤压收集精子样品和解剖收集精巢组织。在第一种方法中，操作的雄鱼可以继续存活，用于其他实验或反复用于冻存；采集精子样品的过程可见，可凭经验一定程度判断收集到的精子样品的质量。但是每次收集到的精子样品体积很有限。在第二种方法中，雄鱼被杀死，不能继续使用。解剖出精巢后，组织在冻存液中充分研磨、分离上清、分装、冻存保藏。一条雄鱼，一次可收获较大的样品量，数倍于活体收集，但样品质量不易由肉眼观察判断。
   3. 尽量安排上午时间进行冻存实验，精子样品质量相对好一些。对于已经进行过冻存实验操作的雄鱼，应至少间隔一个月时间再进行下一次冻存。通过挤压鱼体来收集精子样品的操作会对鱼体造成较大的伤害，斑马鱼需要至少一个月的时间恢复健康，并积聚精子。一般一次冻存操作后，鱼的死亡率在10%以内是正常的，超过10%就需要考虑改善实验操作，比如控制挤压的力度，减少麻醉时间，以及增强鱼系的整体免疫力。
2. 冻存试剂配制影响精子冻存质量
   1. 冻存液要求新鲜配制。实验当天使用的10X NaHCO₃，1X GFR，不含甲醇和含甲醇的冻存液都要求当天配制。NaHCO₃容易吸潮变质，需注意保质期。1XGFR溶液和冻存液都需要用到NaHCO₃溶液，必须当天新鲜配制。
   2. 含甲醇的冻存液是真正意义上的冻存保护液，其中甲醇作为冷冻保护剂发挥作用。甲醇是一种小分子化合物，可以快速地渗透到细胞内，帮助细胞适当脱水，减少冷冻过程中的溶质损伤和冰晶损伤；并在复苏时，可以加快复温进程，有利于冻存的细胞经复苏后仍保持正常的结构和功能。
   3. 不含甲醇或含甲醇的冻存液中都包含有脱脂奶粉。脱脂奶粉作为一种胞外冷冻保护剂，可以有效的减少精子尾部的交联，配制好后需要充分溶解。高质量、无化学添加和脱脂完全的奶粉，对于保护精子的细胞活性有很大的帮助。
   4. GFR保护液使用期限不可过长。GFR保护液为斑马鱼精子提供一个渗透压和pH适宜的环境，可延长其体外活性寿命，维持良好生理状态，更好地抵抗低温损伤。GFR保护液有以下几个特性，首先是溶液等渗性，其与斑马鱼精子等渗或接近，可以保持精子的正常结构；其次是其中的各个成分相互不反应，对精子无毒害作用；有一定的缓冲能力，维护精子存活的适宜条件。GFR保护液一般建议每年重新配制一次，使用过滤灭菌，不可高温灭菌。如果使用较长时间后出现冻存效果不佳的情况，则应及时重新配制试剂。
3. 精子样品预处理过程的核心操作要求：快。从收集好精子样品，或足量或补平到3.3 μL，到将混合好冻存保护液的精子样品放入到干冰中，整个操作时间应尽量控制在60秒内。操作时间过长，尤其是加入冻存保护剂后等待时间过长，会严重影响冻存精子的质量。可以通过两人配合完成实验，并多次练习达到熟练操作的要求。
4. 精子样品在干冰中的慢速降温过程，对冻存样品的质量也十分关键。这一步的最佳状态就是精子样品在干冰中均匀降温，最终达到-70 °C左右的冰冻状态。为了达到这一目的，要求用于降温的介质——干冰应尽量匀质，粉末状为最佳，适当压实，内部无空泡，干冰供应量应充足，需要将精子样品深埋入其中。此外还需严格控制慢速降温时间。斑马鱼精子是体积较小的细胞，在超低温冻存操作中，降温速率不宜过慢，常用的降温速度为4-5 °C/分钟。精子样品在干冰中的降温时间应严格控制在20分钟。
   

溶液配方

1. 麻醉剂Tricaine储液
   称取400 mg Tricaine溶于90 mL去离子水中，加入2.1 mL Tris（1 M，pH9.0）调节pH至7.0，定容至100 mL，4 °C短期储存，-20 °C长期储存。使用时，将4.2 mL tricaine储液稀释于100 mL清洁的斑马鱼养殖用水中，终浓度168 µg/mL，工作液要求现用现配。
2. 10x Ginsburg Fish Ringers（GFR）溶液（不含NaHCO3）
   在400 mL 去离子水中依次溶解32.5 g NaCl，1.25 g KCl，1.75 g CaCl₂·2H₂O，定容至500 mL，过滤除菌，4 °C储存。终浓度依次为65 µg/mL NaCl，2.5 µg/mL KCl，3.5 µg/mL CaCl₂·2H₂O。所有试剂按照顺序依次加入，每一种充分溶解后再加入下一种，避免产生沉淀。保质期为1年左右。
3. 10x NaHCO₃
   称取0.10 g NaHCO₃溶于50 mL去离子水中，终浓度2 µg/mL。要求现用现配。
4. 1x GFR溶液
   以50 mL溶液为例，在40 mL去离子水依次加入5 mL 10x GFR溶液和5 mL 10x NaHCO₃，混匀即可。要求现用现配。
5. 不含甲醇（Methanol）的冻存液
   以10 mL溶液为例，在10 mL 1x GFR溶液加入1.5 g脱脂奶粉，充分混匀，可以使用混合器混合20-30分钟。要求现用现配。
6. 含甲醇的冻存液
   以10 mL溶液为例，在9 mL 1x GFR溶液加入1 mL甲醇，混匀后再加入1.5 g脱脂奶粉，充分混匀，可以使用混合器混合20-30分钟。要求现用现配。
   

致谢

国家斑马鱼资源中心得到科技部财政部国家科技资源共享服务平台；国家重点研发计划（2018YFA08010000）；中国科学院生物资源科技服务网络计划动物实验平台项目；湖北省自然科技资源库等项目的支持。该实验方法改编自之前的研究工作（Draper and Moens, 2009）。

参考文献

1. Carmichael, C., Westerfield, M. and Varga, Z. M. (2009). Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.Methods Mol Biol 546: 45-65.
2. Draper, B. W. and Moens, C. B. (2009). A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. J Vis Exp(29).
3. Gupta, T. and Mullins, M. C. (2010). Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp(37).
4. Harvey, B. (1982). Cryopreservation of zebrafish spermatozoa using methanol.can J zool.
5. IV, J. P. M. (2003). Zebrafish sperm cryopreservation with dimethylacetimide biotechniques. BioTechniques.
6. Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M. and Tiersch, T. R. (2007). Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.Theriogenology 68(2): 128-136.

附图1. 海绵鱼托制作图示. 黑色实线为可见外边框，蓝色虚线为不可见（或后面遮挡）部分，红色虚线为剪刀裁剪后缝隙部分。