Natural Breeding and Embryo Culture of Zebrafish

材料与试剂

1. 配种缸（上海海圣，货号：HS022）
2. 90 mm培养皿（海门，货号：HC030）
3. 3 mL塑料吸管（海泰，货号：HC001）
4. 鱼捞（上海海圣，货号：HS018）
5. 鱼卵捞网（上海海圣，货号：HS019）
6. 性成熟雌、雄斑马鱼
7. 8%次氯酸钠溶液（3A，catalog number: A04633）
8. 亚甲基蓝（Meryer，catalog number: F70013）
9. NaCl（国药，货号：10019318）
10. KCl（国药，货号：10016318）
11. MgSO₄（国药，货号：20025118）
12. KH₂PO₄（国药，货号：10017608）
13. Na₂HPO₄（国药，货号：10020318）
14. CaCl₂（国药，货号：10005861）
15. NaHCO₃（国药，货号：10018960）
16. 胚胎养殖水（见溶液配方）
    100× E2A储存液
    500× E2B储存液
    500× E2C储存液
17. 胚胎消毒储存液（6%次氯酸钠）（见溶液配方）
18. 亚甲基蓝储存液（5 g/L）（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 斑马鱼循环养殖系统（ESEN, model: AW-RC12）
2. 体视显微镜（olympus, model: SZ2-LGB）
3. 恒温培养箱（精宏，型号：HWS-080，中国）
   

实验步骤

斑马鱼（Danio rerio），英文名称zebrafish，属硬骨鱼类，辐鳍鱼纲（Actinopterygii），鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鲐属（Danio），原产于印度及孟加拉国的淡水水域，为杂食性热带淡水鱼类(Kimmel, 1989; Engeszer et al., 2007)。因其具有体型小、易于养殖、繁殖周期短、发育迅速、产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎透明、基因组与人类同源性高等优势 (Xie et al., 2015; Viets et al., 2016)，近20年来斑马鱼被广泛应用于遗传学 (Davis et al., 2014)、发育生物学 (Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996)、神经生物学 (Stewart et al., 2014)、再生和干细胞研究 (Gemberling et al., 2013)、疾病模型和药物筛选 (Rennekamp and Peterson, 2015)、环境毒理学 (Dai et al., 2014)等科研领域。
斑马鱼成体雌鱼为蓝色与银灰色相间条纹，体态丰满，腹部膨大银亮；成体雄鱼为蓝色与柠檬色相间条纹，身材修长，腹部扁平，臀鳍根部略显金黄。斑马鱼的适宜生长温度为20-30 °C，实验室常用养殖水温为25-28 °C，观察胚胎发育进程的标准养殖温度为28.5 °C。因斑马鱼在生理和行为学上呈现出明显的昼夜节律，光暗周期的变化可直接启动其生物节律进而影响斑马鱼的产卵交配，故斑马鱼养殖环境中稳定的光周期对于配鱼产卵的成功至关重要。斑马鱼常用光照周期为14小时明/10小时暗周期 (王明勇，黄国栋，王晗, 2012)，每个明周期开始后3小时内为繁殖产卵活跃期。斑马鱼的自然寿命约3到5年，实验室环境下性成熟期约为3个月，而6至18月龄的斑马鱼繁殖能力较强。在合适的饲养条件下，成年斑马鱼全年皆可交配产卵，两次产卵仅需间隔一周，一对健康的成年斑马鱼一次交配可产卵200枚以上。所产卵为非黏性卵，直径约为1 mm，沉积于缸底(Brown et al., 2016)。下文将详细介绍实验室内斑马鱼的自然繁育过程。

1. 实验前准备
   1. 为提高斑马鱼的产卵量，应在交配前1至2周对雌雄成鱼增添活饵料投喂。长期规律地用于产卵的成鱼应坚持每日2次以上活饵料饲养。
   2. 配鱼产卵的前一天应准备装有养殖水的配种缸，水量约占配种缸体积的三分之二。配种前对鱼进行投喂。配种缸由内缸、外缸、隔板、盖板四部分组成，外缸盛水可保障鱼适宜生存环境；内缸下方为镂空结构，便于鱼卵下沉，可阻止亲鱼接触吞掉鱼卵；隔板分离成年雄雌鱼，防止雌雄鱼接触过早相互攻击或者提前接触产卵；盖板放置于配种缸顶部，防止鱼跳出（图1）。
      
      
      图1. 配种缸内挡板隔开的雌雄鱼（隔板右侧是1尾雄鱼，左侧是2尾雌鱼）
      
      
2. 斑马鱼的选取与配鱼
   1. 成年雌雄鱼鉴别：相同饲养条件下，同龄成年雌鱼体型比雄鱼稍大，腹部也更膨大。但是由于卵巢孕育鱼卵的情况不同，雌鱼的腹部也可能相对扁平；而雄鱼在刚刚摄食或腹腔生长肿瘤等情况下也可能腹部膨大，因此观察体型只能对分辨雌雄鱼起到辅助作用。在实验中更推荐使用观察体色的方式来判断雌雄鱼。雌鱼的条纹偏银色，腹部膨大银亮，体型丰满；雄鱼体型修长，条纹为柠檬黄，臀鳍根部呈现金黄色（图2）。
   2. 下午投喂一小时后，将成年雌、雄鱼按照1:1或2:1比例放入准备好的配种缸内，密度不易过高(常规0.8L配种缸内不应放置超过4尾鱼)，雌雄鱼用隔板分开，并盖上顶部盖板（图1）。
   3. 将配种缸放置在鱼房养殖环境下，按照斑马鱼日常作息规律，放置过夜。
      
      
      图2. 成年野生型（AB品系）斑马鱼。图片上方为雄鱼，体型修长，体色为柠檬色，腹部扁平。图片下方为雌鱼，体型丰满，腹部膨大，体色银灰。同龄雌鱼较雄鱼体型略大。
      
      
      
3. 自然交配与鱼卵收集
   1. 次日早上按照鱼房正常光周期给予光照，并给配种缸内斑马鱼换水。明周期开始后的半小时内，雌雄鱼会出现明显的相互吸引行为，频繁接近隔板，在隔板附近区域游动。此时抽取隔板，雌雄鱼会迅速开始彼此接触，并可能产卵。明周期开始后三小时左右，如仍未抽取隔板让雌雄鱼接触，则雌鱼可能开始将卵巢内的卵子逐渐降解吸收。此后，即便给予雌雄鱼接触机会，交配产卵的成功率会大大降低。因此，收集鱼卵的最佳时间段为明周期开始后的30分钟之内，如需要延迟收集受精卵，最多不要超过明周期开始之后的3小时。换水方式为：准备另一外缸，加入新鲜养殖水至体积的三分之一，将内缸（内有斑马鱼）转移至其中。
      抽取隔板使雌、雄鱼接触，雌、雄鱼在明周期开始后很快出现追逐行为，并开始交配产卵（视频1）。交配期间，尽量避免干扰。原缸水体经鱼过夜排泄废物，氨氮含量可能过高，换水可以降低水体氨氮含量，保持水体清洁度，同时适量减少缸内水量，水层浅有助于雌雄鱼交配产卵。如为了试验需要，例如进行显微注射期间，为了保证收集的受精卵处于1-2细胞期，则可通过控制抽取隔板的时间，或更换外缸等方式，保证试验期间都可收集到合适年龄的受精卵。
      
      
      
      视频1. 斑马鱼的自然交配产卵
      
      
   2. 待亲鱼产卵后，鱼卵会沿配种内缸底部缝隙沉积于外缸底部。产卵一定时间后，可以把亲鱼再换置到一缸干净养殖水内，亲鱼可能会继续产卵。产卵结束后，开始收集配种缸内的鱼卵。将外缸内的水缓慢倒入鱼卵捞网，鱼卵会被收集在捞网中，之后用胚胎养殖水清洗鱼卵2~3次，清洗过程中用吸管弃掉粪便、死卵等杂质。
   3. 放置鱼卵到装满胚胎养殖水的平皿内，在28.5 °C恒温培养箱内养殖，可无光照培养，但如条件允许或从事与生物节律有关的科研工作，培养箱与成鱼养殖环境的光周期保持一致或根据实验需要进行调节。对于直径为90 mm的培养皿，鱼卵养殖密度在50颗/皿为宜。
   4. 在培养皿外贴上标签，标签上须注明胚胎名称，出生日期等信息（图3）。
      
      
      图3. 自然配鱼收到的鱼卵
      
      
      
4. 受精卵的分拣与消毒
   1. 分拣：待收集鱼卵发育3至6小时之间于显微镜下分拣出受精卵。28.5 °C培养条件下，产卵后约3小时进入1000细胞期，6小时胚盾开始形成，期间是较容易观察分辨受精与未受精鱼卵的时期。只有正常受精的鱼卵才能发育成胚胎。
   2. 消毒：为保证养殖系统的健康，分拣出来的胚胎参照如下方式进行消毒（胚胎应在受精24 小时内，卵膜依然完整的情况下进行消毒）(Westerfield, 2007)：
      1)

      滤去胚胎养殖平皿中的养殖水，向平皿中加入适量现配的胚胎消毒液（0.003%次氯酸钠溶液），加入体积必须可以完全淹没需消毒的胚胎。
      2)

      将挑拣出的胚胎放置于消毒工作液中5分钟。期间轻轻地摇动平皿，保证胚胎卵膜与消毒液充分接触。
      3)

      滤去胚胎消毒液，在平皿中加入灭菌胚胎养殖水，加入体积必须完全淹没胚胎，放置5分钟，期间轻轻地摇动平皿，保证胚胎卵膜得到充分清洗以去掉残留氯离子。
      4)

      重复操作步骤1)-3)的步骤1次。
      5)

      用灭菌胚胎养殖水反复清洗胚胎2次，保证次氯酸钠全部清洗掉。
   3. 消毒后的胚胎放置于含0.5 mg/L亚甲基蓝的胚胎养殖水中，并于28.5 °C恒温培养箱内静水养殖，其中亚甲基蓝的作用是抑制霉菌生长(Varga, 2011)。
   4. 每天检查胚胎的发育状况，挑出败育的死胚和发育畸形的胚胎，每日换水一次。

结果与分析

产卵当日，抽取隔板后2小时，一对成年斑马鱼正常情况下可产卵200枚以上，胚胎通体透明，卵膜在水中1至2分钟后即可膨起，10分钟后动物极膨出（图4）。
收集后的鱼卵于显微镜下观察，可以看到正常受精的鱼卵在28.5 °C标准培养温度下，动物极膨出45分钟发生第一次卵裂，进入2细胞期（图4A）；3小时后进入1000细胞期（图4B）；5小时后进入50%外包期，细胞开始内卷，之后依次出现胚环及胚盾（图4C）；而未受精鱼卵可能在早期也会膨起动物极，并发生1-2次假性细胞分裂，但是分裂不规律，而且不会继续发育（图4D）。待收集鱼卵发育至1000细胞期时于显微镜下分拣出受精卵，养殖于含0.5 mg/L亚甲基蓝的胚胎养殖水中。


图4. 受精和未受精鱼卵的鉴别. A. 为2细胞期胚胎；B. 为1000细胞期胚胎；C.为胚盾（shield）期胚胎；D. 为发生过假性分裂的未受精鱼卵.

失败经验

自然交配后，斑马鱼不产卵、产卵量少可能有以下几方面原因：

1. 产卵用雌雄斑马鱼未性成熟。正常养殖情况下，斑马鱼3个月左右性成熟。如喂养不足，无活饵料喂养且使用的颗粒饲料蛋白质含量不高，会造成3月龄的斑马鱼仍未性成熟的情况，此时配鱼就会不产卵。足量高蛋白和活饵料喂养可以促进斑马鱼发育，尽早性成熟。
2. 已性成熟的斑马鱼投喂不足。斑马鱼日常投喂饵料不足，或者投喂的颗粒饲料中淀粉含量过高，都可能导致其不产卵或者产卵量低。故用于产卵的斑马鱼每日不得投喂少于2顿活饵料，或者投喂的颗粒性饲料应有较高蛋白质含量。
3. 斑马鱼性成熟后第1、2次交配可能不产卵、产卵周期较长，产卵量少。坚持足量的高蛋白喂养，随着斑马鱼的继续发育，产卵量情况就会改善。6-18个月的斑马鱼是最适产卵年龄。
4. 频繁使用的斑马鱼雌雄未分开饲养。未分开的雌雄鱼可能在鱼缸内完成交配产卵并吞食掉鱼卵，而在人工配鱼的时候不再产卵，故每月2次以上用于产卵的斑马鱼应雌雄分开饲养。
5. 雌雄分开饲养的斑马鱼，长期未进行交配产卵之后，首次使用可能产卵少、受精率低，或胚胎死亡率高。这是由于长时间不交配产卵的雌鱼可能卵子质量降低、卵巢积蓄坏卵或患卵巢炎症等相关疾病。因此，非经常用于交配产卵的斑马鱼应雌雄混合饲养。已雌雄隔离时间过长的雌鱼可人工协助清除腹内的坏卵，具体方法为：将雌鱼充分麻醉，侧面放置于平皿中，用左手食指轻轻抵住鱼背，右手食指轻轻挤压雌鱼腹部，看到泄殖孔中排出坏卵（图5），再精心养殖一周后可用于自然交配产卵。
   
   
   图5. 麻醉按压雌鱼腹部操作图
   
   
6. 雌雄鱼不追逐，无法形成正确的伴随游动。可能原因如下：
   
   1. 雌雄鱼年龄和体型相差过大。斑马鱼胚胎为体外受精、体外发育，受精过程需要雌雄鱼有正常的伴随游动。年龄和体型相差过大的斑马鱼可能无法形成正确的伴随游动，体量过小的雄鱼也可能不敢追逐体量较大的雌鱼，造成产卵量少或者不产卵，故配对产卵应使用年龄相仿，体型大小接近的斑马鱼。
   2. 1比1比例配鱼时未插隔板。配种缸内未用隔板将雌雄鱼分隔过夜可能会导致雌雄鱼相互撕咬，而在明周期开始后无法正常交配产卵，故配鱼时应严格按照标准操作，配种缸内插上隔板过夜。
   3. 交配环境不利于斑马鱼繁殖。交配环境中的水温和室温太高或者太低均不利于斑马鱼追逐产卵，光照周期紊乱会直接造成斑马鱼不产卵，配种缸内水位过高也会影响雌雄鱼追逐产卵。故交配环境需保持适合斑马鱼生长繁殖的26-28 °C，光照周期稳定，配种缸置换新鲜养殖水且保持较浅的水层，都有利于促进雌雄鱼追逐。此外，交配过程中尽量避免人为干扰。
   4. 彼此释放产卵交配信号太弱无法感知，这时可以考虑第二次配鱼时更换雌/雄伴侣或者加强饲养一段时间再次让鱼交配。
      
7. 收集的鱼卵高密度放置。培养皿内放置鱼卵密度过高可能会导致水质变坏，造成鱼卵较高死亡率，故鱼卵养殖密度应适宜，以每90 mm培养皿中放置50枚胚胎为宜。
   

溶液配方

1. 胚胎养殖水（Embryo Medium）
   100× E2A储存液
   取140 g NaCl， 6 g KCl，19.2 g MgSO₄，3.3 g KH₂PO₄，1.1 g Na₂HPO₄溶于1600 mL无菌去离子水中，4 °C长期储存。
   
   500× E2B储存液
   取11 g CaCl₂溶于200 mL无菌去离子水中，-20 °C长期储存。
   
   500× E2C储存液
   取6 g NaHCO₃溶于200 mL无菌去离子水中，-20 °C长期储存。
   
   胚胎养殖水（0.5×）
   取100 mL 100× E2A储存液，20 mL 500× E2B储存液，20 mL 500× E3C储存液于19 L无菌去离子水中，调节pH至7.0后定容至20 L，配置成胚胎养殖水（0.5×），高温消毒后常温短期储存。
2. 胚胎消毒储存液（6%次氯酸钠）
   取8%次氯酸钠溶液中加入适量的去离子水，配制成浓度6%的储存液，常温避光保存，保质期6个月。
   使用时，取100 μL胚胎消毒储存液加入到200 mL的灭菌胚胎养殖水中，配置成胚胎消毒液（0.003%次氯酸钠溶液），混匀使用。胚胎消毒液必须现用现配。所有含氯溶液均不可带入鱼房，请在鱼房以外环境进行操作。
3. 亚甲基蓝储存液（5 g/L）
   取0.5 g亚甲基蓝粉末溶于100 mL灭菌去离子水中，配制成5 g/L的亚甲基蓝储存液，常温长期储存。
   使用时，取100 μL亚甲基蓝储存液溶于1000 mL胚胎养殖水中，混匀使用，胚胎养殖水中亚甲基蓝的终浓度为0.5 mg/L。
   

致谢

国家斑马鱼资源中心得到科技部财政部国家科技资源共享服务平台；国家重点研发计划（2018YFA08010000）；中国科学院生物资源科技服务网络计划动物实验平台项目；湖北省自然科技资源库等项目的支持。

参考文献

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