Establishment of Spermatogenic Stem Cell Lines from Tree Shrew

材料与试剂

1. 4月龄至3岁龄雄性树鼩
2. 0.22 μm滤器 (Millipore, catalog number: SLGP033RB)
3. 细胞滤网 (Falcon, catalog number: 352350)
4. 15 ml离心管 (NEST, catalog number: 601052)
5. 50 ml离心管 (NEST, catalog number: 602001)
6. 24孔板 (Corning, catalog number: 3524)
7. 培养皿 (60 mm) (Corning, catalog number: 430166)
   
8. 磁力架 (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-301)
9. 50 ml 注射器 (国产(经销), catalog number: ks001)
10. 冻存管 (Nunc, catalog number: 375418)
11. Trypsin-EDTA (0.25%)，phenol red (Thermo Fisher, catalog number: 25200072)
12. Collagenase IV 胶原酶IV (Gibco, catalog number: 17104-019)
13. DMEM，Powder，High Glucose，Pyruvate (Thermo Fisher, catalog number: 12800017)
14. DNA酶I脱氧核糖核酸酶 (Sigma, catalog number: DN-25)
15. Gibco PSN (Gibco, catalog number: 15640055)
16. 明胶 (gelatin) (Amresco, catalog number: 9764-500 g)
17. Stempro-34 SFM (1×)，liquid (Thermo Fisher, catalog number: 10639-011)
18. FBS QUALIFIED AUSTRALIA ORIGIN 500 ml澳洲胎牛血清 (Thermo Fisher, catalog number: 10099141)
19. 丙酮酸钠100 mM (Gibco, catalog number: 11360-070)
20. MEM Non-Essential Amino Acids Solution，100× (Gibco, catalog number:11140-050)
21. 牛血清白蛋白 (BSA) (Aladdin/阿拉丁, catalog number: 9048-46-8)
22. 2-Mercaptoethanol for molecular biology, for electrophoresis, suitable for cell culture, BioReagent, 99% (GC/titration) (Sigma, catalog number: M3148-500 ml)
23. L-谷氨酰胺 (Sigma, catalog number: 56-85-9)
24. EGF (epidermal growth factor) (Life Technologies, catalog number: PHG0311)
25. Recombinant Human GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) Protein, R&D Systems, catalog number: 212-GD-010)
26. Mouse LIF (leukemia inhibitory factor)(Millipore, catalog number: ESG1107)
27. bFGF (basic fibroblast growth factor) (Millipore, catalog number: GF003)
28. rhWnt3a (R&D, catalog number: 5036-WN)
29. Anti-PE micro beads (Miltenyi/美天旎, catalog number:130-048-801)
30. PE Anti-human CD90 (THY1) (BioLegend, catalog number: 328110)
31. 磁珠柱子MS-columns (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-201)
32. 磁珠柱子LS-columns (Miltenyi/美天旎, catalog number: 130-042-401)
33. Mitomycin C from Streptomyces caespitosus powder (Sigma, catalog number: M4287）
34. 腐胺(putrescine) (Sigma, catalog number: V900377)
35. TS-SSC培养基 (见溶液配方)
36. 胶原酶Ⅳ (见溶液配方)
37. DNA酶I脱氧核糖核酸酶 (见溶液配方)
38. 明胶 (gelatin) (见溶液配方)
39. Mitomycin C from Streptomyces caespitosus powder (20×) (见溶液配方)
40. Glutamine (100×) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 流式细胞仪 (BD，型号：Influx)
2. 恒温水浴锅 (北京水光明医疗器械，型号：001)
3. 细胞培养箱 (Thermo Fisher ，型号：371 气套式)
4. 倒置显微镜 (尼康，型号：TE2000)
5. 超净工作台 (苏净集团安泰公司，型号：SW-CJ-2FD)
6. 高温高压灭菌锅 (YAMATO，型号：全系列)
7. 移液器/移液枪 (Eppendorf，型号Research plus)
8. 超纯水系统 (Millipore，型号Milli-Q)
   

实验步骤

一、树鼩睾丸组织的消化

1. 取2只4月龄至3岁龄雄性树鼩（推荐7月龄-1岁龄左右），断颈处死，将树鼩浸泡在75%医用酒精中消毒，防止毛发中的真菌等物质漂浮空气中影响后续实验操作，但要注意在酒精中浸泡时间不宜太长，以防止树鼩身体僵硬影响后续操作；
2. 取出睾丸，将其置于含有2×双抗的PBS中进行清洗。多清洗几次(3-4次)。然后将睾丸组织转移至超净台中，继续用含有2×双抗的PBS进行清洗。多清洗几次(3-4次), 此步骤注意无菌操作，超净台中所用手术器械需提前灭菌；
3. 去除白膜和残余附睾组织。充分剪碎组织。提前配制好消化液 (DMEM溶液中胶原酶终浓度2 mg/ml，DNA酶终浓度为0.2 mg/ml，双抗2×)。将组织转移至含有消化液的50 ml离心管，37 °C水浴消化30 min-45 min。消化期间每隔5 min摇晃一下，使组织与消化液充分接触。消化完成后，362 × g离心5 min；
4. 0.25%胰酶重悬细胞沉淀。37 °C水浴消化5-10 min，FBS终止消化；
5. 添加20-30 ml DMEM溶液，混匀，用70 μm滤网过滤后，362 × g 离心5 min，弃上清；
6. 添加20 ml DMEM溶液重悬细胞沉淀，混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次。
   

二、树鼩精原干细胞的富集培养

针对精原干细胞的富集实验，主要包括以下三种方式，可根据具体情况选择使用。

1. 磁珠分选
   1.1

   加入10 ml PBS重悬细胞沉淀，混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次；
   1.2

   加入10 ml 1% BSA再洗一次。混匀，362 × g 离心5 min，上清不要倒出来，因为残留的1% BSA会稀释抗体，用移液枪小心吸出；
   1.3

   500 μl 的1% BSA中加入 20 μl THY1抗体重悬细胞，室温滚筒上标记30 min（过一会儿用手弹一下，不要有气泡）；
   1.4

   10 ml的1% BSA吹打混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次；
   1.5

   500 μl 的1% BSA中加入20 μl磁珠抗体（Anti-PE micro beads）重悬细胞。避光，室温滚筒上标记15 min（磁珠在用之前，吹打混匀，严格避光）；
   1.6

   10 ml 的1% BSA吹打混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次；
   1.7

   根据细胞量（5-10 ml），选择合适的1% BSA重悬细胞；
   1.8

   将磁珠分选柱固定在磁力架上，磁珠分选柱下面套上200 μl枪头，向分选柱内呈滴状加入2 ml的 1% BSA润洗；
   1.9

   待液体全部流出后，加入1% BSA重悬细胞样品，使其在自然状态下流出；
   1.10

   待样品全部流出后，再加入2 ml的 1% BSA冲洗；
   1.11

   将分选柱从磁力架上取下，放置在15 ml离心管中，向磁珠分选柱中加入一定量（2-3 ml）的1% BSA，将柱塞推下，使液体流出（若洗脱不干净，可重复该步骤）；
   1.12

   将收集到的样品362 × g 离心5 min，树鼩精原干细胞培养基重悬。将收集到的细胞接种在明胶包被的24孔板上，细胞密度1×10⁵-5×10⁵ 个/孔，记为P0代。
2. 差异贴壁
   树鼩精原干细胞培养基重悬消化后离心的细胞沉淀，按照细胞密度1×10⁵-5×10⁵ 个/孔，将细胞接种在明胶包被的24孔板上，记为P0代。
   
3. 流式分选
   与磁珠分选方式相似。
   3.1

   加10 ml 1% BSA重悬细胞沉淀，混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次；
   3.2

   1 ml 的1% BSA中加入20 μl THY1抗体重悬细胞沉淀，常温避光孵育抗体30 min；
   3.3

   抗体标记结束后，用10 ml PBS重悬细胞沉淀，混匀，362 × g 离心5 min，弃上清，此步骤重复1次；
   3.4

   根据细胞量，用1% BSA重悬细胞至流式专用玻璃管中，进行流式细胞分选，阴性对照的细胞除了不标记抗体外，其余的操作都相同；
   3.5

   分选得到的阳性细胞，树鼩精原干细胞培养基重悬。将收集到的细胞接种在明胶包被的24孔板上，细胞密度1×10⁵-5×10⁵ 个/孔。记为P0代。
4. 培养步骤
   4.1  磁珠分选、流式分选阳性细胞或者直接原代消化的细胞按照细胞密度1×10⁵-5×10⁵ 个/孔接种在明胶包被的24孔板上，培养基中添加10 ng/ml wnt3a，记为P0
          代。培养2天后，弃一半培养基，添加一倍培养基，培养至第4天培养基全部更换，根据皿中体细胞贴壁情况，5天至1周后传代；
   4.2  将培养5-7天的P0代细胞小心的用移液枪吹下来，161 × g 离心5 min，弃上清，树鼩精原干细胞培养基重悬，培养基中添加10 ng/ml wnt3a，细胞密度1×10⁵-
          5×10⁵ 个/孔铺至明胶处理过的24孔板上，记为P1代。隔天半换液，4天后培养基全部更换，根据皿中体细胞贴壁情况，5天至1周后传代；
          注释：在P0-P1高密度的细胞培养中，不积极换液是培养重点，培养基中添加wnt3a有助于精原干细胞对体外环境的适应，建系成功率高。
   4.3  将培养5-7天的P1代细胞小心的用移液枪吹下来，161 × g 离心5 min，弃上清，树鼩精原干细胞培养基重悬，培养基中添加10 ng/ml wnt3a，细胞密度5×10⁴-
          1×10⁵ 个/孔铺至有饲养层细胞的24孔板上，记为P2代。隔天半换液，4天后培养基全部更换，根据凋亡细胞量，5-7天后传代；
          注释：在本周培养过程中可见大量分化细胞的凋亡细胞。
   4.4  饲养层(树鼩支持细胞，tree shrew sertoli cells，TS-STO)制备方式：在P0、P1代时，可以将皿中贴壁的体细胞采用0.05% 胰酶消化后至60 mm皿中培养，培养
          基为DMEM溶液加10% FBS，培养密度维持在6-7天传一代即可。
   4.5  饲养层的处理：在汇合度90%的TS-STO中加入终浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C处理3 h后，PBS洗3次，消化传至24孔板内，细胞密度1×10⁵ 个/ml；
   4.6  将培养5-7天的P2代细胞小心的用移液枪吹下来，161 × g 离心5 min，弃上清，树鼩精原干细胞培养基重悬，培养基中添加10 ng/ml wnt3a，细胞密度5×10⁴-
          1×10⁵ 个/孔铺至有饲养层细胞的24孔板里，记为P3代。隔天半换液，4天后培养基全部更换，5-7天后传代。本周培养中可逐步见到三五成群的葡萄状、不规则
          几何状集落出现；
   4.7  将培养5-7天的P3代细胞小心的用移液枪吹下来，161 × g 离心5 min，弃上清，树鼩精原干细胞培养基重悬，培养基中添加10 ng/ml wnt3a，细胞密度5×10⁴-
          1×10⁵ 个/孔铺至有饲养层细胞的24孔板里，记为P4代。隔天半换液，4天后培养基全部更换，5-7天后传代；
   4.8  P4后细胞集落已能大量扩增，之后以1:3-5传代即可，培养基中已经不用添加wnt3a。

结果与分析

图1. 树鼩精原干细胞系的建立

在建系培养过程中，P2或P3时应该出现如图1中箭头所示的葡萄样集落，之后的培养注意细胞密度即可。

溶液配方

1. TS-SSC培养基
   10 ml 树鼩精原干细胞完全培养基成分
   
   树鼩精原干细胞培养基
   
   
   培养基配制完成后，0.22 μM滤膜过滤后，4 °C保存。建议每次配制培养基时不要配制过多，一般情况下，4 °C保存使用时间推荐在2周以内。
   
2. 胶原酶Ⅳ
   称取0.4 g胶原酶，转移至50 ml离心管中，带进细胞间操作台加入40 ml的DMEM基础培养基，浓度为10 mg/ml，混匀。手动使用注射器和0.22 μm滤器过滤灭菌，分装后放入-20 °C备用；
   
3. DNA酶I脱氧核糖核酸酶
   称取50 mg DNA酶，转移至15 ml离心管中，带进细胞间操作台加入10 ml的PBS，浓度为5 mg/ml，混匀。手动使用注射器和0.22 μm滤器过滤灭菌，分装后放入 -20 °C备用；
   
4. 明胶（gelatin）
   称取0.1 g明胶，转移至玻璃瓶中，加入100 ml 纯水，浓度为0.1%，灭菌锅灭菌后，常温储存；
   
5. Mitomycin C from Streptomyces caespitosus powder (20×)
   在细胞间超净台里操作，2 mg丝裂霉素C中加入10 ml的DMEM基础培养基，混匀，浓度为200 μg/ml，分装后放入-20 °C备用；
   
6. Glutamine (100×)配制方法
   称取1.168 g 的L-谷氨酰胺，转移至40 ml 的PBS中，在细胞间超净台里加入28 μl β-巯基乙醇，混匀。手动使用注射器和0.22 μm滤器过滤灭菌，分装后放入-20 °C备用；

其余试剂按照试剂说明书进行配制及储存。

致谢

相关工作得到了中国科学院（XDB13000000 和XDA01010203）、云南省（2015HA038）、NSFC-云南联合基金项目（U1702284）以及昆明动物所“135”项目资助。实验方案中提到的树鼩精原干细胞分离建系培养方法由李朝晖和班文赞共同建立(班文赞，2016)。相关内容2017年发表于《Cell Research》上(Li et al.,2017)。

参考文献

1. 班文赞. (2016). 树鼩精原干细胞转基因载体的构建. 昆明理工大学硕士学位论文.
2. Li, C. H., Yan, L. Z., Ban, W. Z., Tu, Q., Wu, Y., Wang, L., Bi, R., Ji, S., Ma, Y. H., Nie, W. H., Lv, L. B., Yao, Y. G., Zhao, X. D. and Zheng, P. (2017). Long-term propagation of tree shrew spermatogonial stem cells in culture and successful generation of transgenic offspring. Cell Res 27(2): 241-252.