Establishing Transgenic Spermatogenic Stem Cells of Tree Shrew

材料与试剂

1. 0.45 μm滤器（PALL, catalog number: 4654）
2. 10 ml注射器（国产，HMXL-610）
3. 15 ml离心管（NEST, catalog number: 601052）
4. 50 ml离心管（NEST, catalog number: 602001）
5. 24孔板（Corning, catalog number: 3524）
6. 培养皿（100 mm）（Corning, catalog number: 430167）
7. HEK293T细胞
8. 载体
   病毒载体和包装载体：GAE-CAG-eGFP/WPRE、SIV3+、G-REV来自Wianny et al., 2008
   
9. Lipofectamine 3000（Thermo Fisher, catalog number: L3000015）
10. 病毒浓缩试剂盒（Biomiga, catalog number: V2001-01）
11. PBS（Hyclone, catalog number: SH30256.01B）
12. Polybrene（SIGMA, catalog number: 107689）
13. DMEM培养基（Thermo Fisher, catalog number: C11995500BT）
14. 胎牛血清FBS（Thermo Fisher, catalog number: 10099141）
15. 胰酶（Thermo Fisher, catalog number: 25200072）
16. 5 mg/ml polybrene（见溶液配方）
17. 树鼩精原干细胞培养基（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 流式细胞仪（BD）
2. 细胞培养箱（Thermo Fisher）
3. 倒置荧光显微镜（尼康）
4. 超净工作台（苏净集团安泰公司）
5. 高温高压灭菌锅（YAMATO）
6. 移液器/移液枪（Eppendorf）
7. 超纯水系统（Millipore）
8. 平板离心机（Thermo Fisher）
9. 细胞计数器（Countstar）
10. 分析天平（Mettler Toledo）
    

实验步骤

1. 病毒包装与浓缩
   1.1

   病毒载体的选择
   前期对适合用于树鼩精原干细胞转基因的病毒载体进行探索和优化，发现基于猴免疫缺陷病毒的SIV载体（GAECAG-eGFP/WPRE）构建的病毒对于树鼩精原干细胞具有较高的感染效率（班文赞，2016）。
   
   1.2

   细胞转染
   转染前24 h，将对数生长期的HEK293T 细胞传至10 cm细胞培养皿，过夜培养。 当细胞长至70-80%，用Lipofectamine 3000将携带目的基因的CAE-CAG-eGFP/WPRE载体和包装载体（SIV3和G-REV）根据以下比例进行转染（CAE-CAG-eGFP/WPRE : SIV3+ : G-REV = 1.3:1:1），转染质粒总量为12.5 μg。
   
   1.3

   病毒收集浓缩
   转染后48小时，收集细胞培养基上清，以0.45 μM 滤器过滤上清；用Biomiga病毒浓缩试剂盒根据说明书进行浓缩。
   
   1.4

   病毒滴度测定
   将293T细胞传至24孔板中的10个孔。取10 μl浓缩好的病毒，加到1 ml细胞培养基中，得到10^-2浓度的病毒培养液，并将其以10倍的比例倍比稀释，依次得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8浓度的培养基各1 ml。将24孔板中的培养基换成不同浓度的病毒培养液。24小时后，在荧光显微镜下观察细胞的病毒感染情况，选取GFP阳性细胞数量为10个左右的孔，如果该孔的病毒浓度是10^-7，那么我们包装的病毒的滴度大概为：10/10^-7 = 10⁸ TU/ml。
   
2. 精原干细胞慢病毒感染
   2.1

   细胞准备
   精原干细胞的生长周期一般是7天，准备一个24孔板的传代后5天左右的精原干细胞，用PBS重悬，转移至15 ml离心管，用细胞计数器计数，细胞总数在3x10⁶-5 x10⁶个。
   
   2.2

   配制病毒孵育液
   1 ml 精原干细胞培养基 +1 μl Polybrene（5 mg/ml） + 100 μl浓缩的病毒（10⁸ TU/ml）。
   
   2.3

   病毒感染
   将细胞161 × g 离心5 min，弃去上清，吸取配制好的病毒孵育液重悬细胞，置于培养箱中悬浮感染24小时。
   
   2.4

   细胞接种
   病毒感染24小时后，161 × g 离心5 min，弃去病毒孵育液，将细胞用6 ml精原干细胞培养基重悬，接种到提前制备好的饲养层细胞上（24孔板的12个孔，关于饲养层细胞的制备，详见研究方案“树鼩精原干细胞系的分离和建系培养”）。隔天换液培养。
   
3. 转基因精原干细胞筛选
   3.1

   病毒感染后48小时，可以通过荧光显微镜看到发绿色荧光的精原干细胞集落；
   3.2

   通过流式细胞仪，分选出绿色荧光阳性的细胞，继续传代扩增培养。
   注：以上实验过程中，涉及到使用病毒转基因工具，因此所有操作均应在生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，高压灭菌以后再进行下一步处理。显微镜和生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭，并紫外照射消毒。
   

经验总结

流式分选过程容易导致精原干细胞污染，因此需要多加注意。也可用挑取单克隆的方式富集转基因阳性的精原干细胞。

溶液配方

1. 5 mg/ml polybrene
   用分析天平称取5 mg的polybrene，用1 ml的PBS溶解，分装冻存于-20 °C。
   
2. 树鼩精原干细胞培养基
   详见研究方案“树鼩精原干细胞系的分离和建系培养”
   

致谢

相关工作得到了中国科学院（XDB13000000和XDA01010203）、云南省 （2015HA038）、NSFC-云南联合基金项目（U1702284）以及昆明动物所“135”项目资助。利用本研究相似的方案，我们建立了GFP转基因树鼩，相关工作于2017年发表于《Cell Research》（Li et al., 2017）。前期班文赞、李朝晖等系统探索了不同病毒载体在精原干细胞中的转基因效率，为本实验方案提供了非常有价值的参考（班文赞，2016）。

参考文献

1. 班文赞. (2016). 树鼩精原干细胞转基因载体的构建. 昆明理工大学硕士学位论文.
2. Li, C. H., Yan, L. Z., Ban, W. Z., Tu, Q., Wu, Y., Wang, L., Bi, R., Ji, S., Ma, Y. H., Nie, W. H., Lv, L. B., Yao, Y. G., Zhao, X. D. and Zheng, P. (2017). Long-term propagation of tree shrew spermatogonial stem cells in culture and successful generation of transgenic offspring. Cell Res 27(2): 241-252.
3. Wianny, F., Bernat, A., Huissoud, C., Marcy, G., Markossian, S., Cortay, V., Giroud, P., Leviel, V., Kennedy, H., Savatier, P. and Dehay, C. (2008). Derivation and cloning of a novel rhesus embryonic stem cell line stably expressing tau-green fluorescent protein. Stem Cells 26(6): 1444-1453.