In vitro Fertilization of the Mongolian Gerbil Egg

材料与试剂

1. 矿物油(sigma, catalog number: M8410)
2. 体外获能液（自行配置）
3. 体外受精液（自行配置）
   

仪器设备

1. CO₂培养箱（Thermo）
2. 倒置显微镜(LAICA)
3. 35 mm培养皿(Corning, USA)
4. 手术器械（镊子，手术剪，显微镊，显微剪）
   

实验步骤

实验前准备

1. 雌鼠的超数排卵：参照其他部分。
2. 液滴平衡：取获能液和受精液在35 mm培育皿中分别作获能液滴（300 μL/滴）和受精液滴 (200 μL/滴)，用矿物油覆盖液滴，在使用前30分钟平衡。
   

实验步骤

1. 精子的获取与获能：
2. 取4月龄有繁育能力的雄鼠，颈椎脱臼处死，腹部75％酒精消毒，打开腹腔，取附睾尾。用眼科剪小心将附睾尾周围的脂肪剥离，在灭菌滤纸去除血迹和脂肪，用拇指和食指轻轻挤压附睾尾，同时用1 mL注射器针头刺破附睾尾，待破口处涌出乳白色的精子团后用1 mL注射器针头挑出30微升精子，置于预先平衡液滴中,在5％ CO₂、95％空气、饱和湿度100%、37 °C培养箱中获能4 h。
3. 卵子的获取：参照其他部分。
4. 体外受精：用10 μL移液枪从获能液滴的周边吸取10μL精子加入到有卵丘团的受精液中，每200 μL液滴中含40-60个卵母细胞，二氧化碳培养箱孵育8-9 h。
   

结果与分析

受精培养8-9 h后将卵子移出（图1~2），置于受精液中洗3遍，移入预先平衡的受精液中继续培养48 h 后观察2-cell发育率（图3~6）


图1. 超排后卵巢


图2. 体外受精中


图3. 体外受精率47.5%


图4. 体外受精率58.1%


图5. 体外受精率65.2%


图6. 体外受精率84.6%

溶液配方

1. 体外获能液
   组成成分为：NaCl、KCl、NaHCO₃、葡萄糖、丙酮酸钠、牛磺酸、肾上腺素、BSA、MgCl₂·6H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、CaCl₂·2H₂O、酚红（0.5％）、青霉素G、硫酸链霉素及DL⁃乳酸钠溶液，pH 值为（7.35 ± 0.10），渗透压为（315 ± 5）
   
2. 体外受精液（组成成分除BSA加倍外，其余同体外获能液。）

致谢

感谢国家自然科学基金项目（Nos. 31572341, 31572347, 31772545, 31572348）、国家科技支撑计划项目（No. 2015BAI09B00）和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)资助。

参考文献

1. 郭红刚，李莉，周生来，卢领群，李坤，杜江涛，石巧娟，金秀清，李长龙，萨晓婴，应华忠，褚晓峰. (2017). 长爪沙鼠体外受精与早期胚胎体外培养体系的初步建立. 中国实验动物学报 25: 624-631.