Embryo Transfer in Mongolian Gerbils

材料与试剂

1. 带有托盘鼠笼（苏杭实验动物设备厂）
2. 35 mm、10 cm细胞培养皿（美国Corning公司，catalog number: 430165，430167）
3. 口吸管（美国Sigma Aldrich公司，catalog number: A5177）
4. 孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）（中国宁波第二激素厂）
5. 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（中国宁波第二激素厂）
6. 戊巴比妥那（中国北京索莱宝科技有限公司）
   
7. M2培养基 （美国Sigma Aldrich公司，catalog number: M7167）
8. 石蜡油（美国Sigma Aldrich公司，catalog number: M8410）
   

仪器设备

1. 解剖镜（德国Leica公司，EZ4W）

实验步骤

1. 假孕受体沙鼠制备
   使用10～12周雌性长爪沙鼠作为受体沙鼠进行实验，以10 IU/只的剂量注射PMSG和hCG，注射间隔时间为70 h，具体步骤如下：在第一天16～17时腹腔注射PMSG，第四天14～15时腹腔注射hCG，注射剂量均为10 IU/只。与输精管结扎的雄性沙鼠合笼，因沙鼠阴道栓极易脱落，应在含有托盘（图1）的笼内交配，通过观察托盘内是否有掉落的阴道栓判断交配是否成功。阴道栓检测阳性即可确认作为假孕受体沙鼠即假孕0.5天。
   
   
   图 1. 带有托盘的鼠笼
   
   
2. 受精卵移植
   （1）麻醉：在胞质注射完成半小时后，将当日检栓/假孕0.5 dpc的假孕沙鼠进行称重，并以100 mg/kg的剂量注射1%戊巴比妥那使其麻醉。沙鼠完全麻醉后将其腹部朝下置于擦手纸上进行后续操作。
   （2）暴露生殖道：用眼科剪将沙鼠左侧背部去毛，用75%消毒酒精喷洒背部并用酒精棉球擦净进行消毒。在左侧背部约卵巢的位置剪开约1 cm的小口，依次剪开皮肤、肌肉等，直至可以接触到输卵管和卵巢。用镊子夹住脂肪垫以便将脂肪垫、卵巢和输卵管拉出体外。
   （3）将胚胎吸入移卵管：在10 cm细胞培养皿中滴加几滴预热的M2培养基，用口吸管吸出20～22枚存活的培养0.5 dpc的胚胎（如图2所示，一般移植20～22枚卵可产子7个左右，接近于沙鼠自然交配产仔数），并在M2液滴中进行洗涤。在吸入胚胎之前，吸一小段M2培养基、吸一小段空气，反复2～3次，再将胚胎吸入到移卵管中。
   （4）胚胎移植：再次用镊子将沙鼠的卵巢和输卵管拉出体外，用小动脉夹夹住脂肪垫固定生殖道，若没有脂肪垫，则夹住血管较少的系膜处。在体视解剖镜下，找到输卵管伞口，用显微镊去除包裹输卵管伞口的透明的膜，沿着输卵管的方向将移卵管插入输卵管伞口，并将胚胎和一个气泡轻吹入沙鼠输卵管中。松开动脉夹，用镊子将沙鼠的卵巢和输卵管及生殖道从切口放回，并缝合切口，为动物保温，直至沙鼠清醒后，放回鼠笼单笼饲养。
   
   
   图 2. 移植不同数目胚胎后的产仔数
   
   

致谢

本研究得到国家自然科学基因（31672375,31872308,31970512,31572348）和“十三五”时期北京市属高校高水平教师队伍建设支持计划(IDHT20170516)资助。

参考文献

1. 王妍. (2019). 利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除长爪沙鼠动物模型. 首都医科大学硕士学位论文.
2. Wang, Y., Zhao, P., Song, Z., Du, X., Huo, X., Lu, J., Liu, X., Lv, J., Li, C., Guo, M. and Chen, Z. (2020). Generation of gene-knockout Mongolian gerbils via CRISPR/Cas9 system. Front Bioeng Biotechnol 8: 780.