Superovulation and Collection of Eggs in Mongolian Gerbils

材料与试剂

1. 35 mm无菌塑料培养皿（Corning, catalog number: 430165）
2. PMSG（孕马血清促性腺激素）(中国宁波第二激素厂)
3. hCG（人绒毛膜促性腺激素）（中国宁波第二激素厂）
4. 氯化钠生理盐水注射液（中国山东华鲁制药有限公司）
5. M2 培养基（Sigma, catalog number: M7167）
6. M16 培养液（Sigma, catalog number: M7292）
7. 透明质酸酶（Sigma, catalog number: H3506）
8. 石蜡油（Sigma Aldrich, catalog number: M8410）
9. 生理盐水（国产）
10. 75%酒精（国产）
11. 孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin, PMSG）注射液（见溶液配方）
12. 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）注射液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 体视显微镜（Nikon）
2. 倒置显微镜（Nikon）
3. CO₂培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）
4. 超净工作台（北京半导体设备一厂）
5. 灭菌手术器械（眼科剪、眼科镊、显微剪和显微镊等）
   

实验步骤

1. 长爪沙鼠超数排卵
   选取6～8 周雌性长爪沙鼠作为受精卵的供体沙鼠，体重45±10 g，以10 IU/只的剂量进行PMSG和hCG腹腔注射，注射间隔时间为70 h。具体步骤如下：在第1天16～17 时腹腔注射PMSG，第4天14～15 时腹腔注射hCG，剂量均为10 IU/只，即0.1 ml，注射激素后，将每只雌性沙鼠分别与一只雄性沙鼠合笼至第5天8时。
   
2. 取卵
   ①取卵前准备：取卵前1天制作微滴培养系统：向35 mm 细胞培养皿中滴加M2培养基，每一滴约20 μl，并加入2 ml石蜡油完全覆盖M2培养液滴，将该培养系统放置于CO₂培养箱中平衡过夜，培养条件为37 °C、5% CO₂和饱和湿度。同时将分装M2培养基放置于CO₂培养箱中平衡过夜。
   ②取输卵管：在激素注射的第5天9～10 时，将沙鼠于超净工作台中断颈处死，腹部朝上置于擦手纸上，用75%酒精喷洒沙鼠腹部进行消毒。用手术剪和镊子剖开腹部，暴露腹腔，并沿其子宫找到沙鼠的输卵管和卵巢，剪下沙鼠输卵管，移到预热的M2培养基中。
   ③取卵：向35 mm 细胞培养皿中滴加200 μl 预热的M2培养基，并在体视解剖镜下依次将沙鼠输卵管放入M2液滴，体视显微镜下用显微镊划开输卵管膨大部时沙鼠受精卵团流出。然后将获得的沙鼠受精卵用100 μl 透明质酸酶消化约1 min，期间用200 μl移液器进行吹打，辅助消化。
   ④洗卵和培养：向35 mm 细胞培养皿中滴加4滴预热的M2培养基，每滴约50 μl。将获得的消化完全的沙鼠受精卵用口吸管移到新的M2微滴中进行清洗，共清洗3～4 次，直至卵丘细胞完全脱落，获得形态好的单个受精卵。用口吸管将洗净的受精卵转移到事先准备好的微滴培养基中，放置于CO₂培养箱中进行培养。
   

溶液配方

1. 孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin, PMSG）注射液
   将一支PMSG 粉末（1000 IU/支）溶于10 ml 生理盐水中，充分溶解后，1 ml/管分装冻存，使用前低温溶解。
   
2. 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）注射液
   将一支hCG 粉末（1000 IU）溶于10 ml 生理盐水中，充分溶解后分装冻存，使用前低温溶解。
   

致谢

感谢国家自然科学基金项目（Nos. 31572341, 31572348, 31772545）和国家科技支撑计划项目（No. 2015BAI09B00）的资助。

参考文献

1. 路静, 朱祥宇, 王超, 王迎, 陈振文 和 杜小燕 (2012). 周龄和激素水平对长爪沙鼠超数排卵效果的影响. 中国比较医学杂志 22(008): 15-17.
2. 唐旺, 李长龙, 杜小燕 和 陈振文 (2015). PMSG和hCG诱导长爪沙鼠超数排卵方案的优化. 中国比较医学杂志 000(007): 59-63.
3. 唐旺. (2016). 长爪沙鼠CRISPR/Cas9基因敲除方法的初步建立. 首都医科大学.
4. 王妍，陈振文. (2019). 利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除长爪沙鼠动物模型. 首都医科大学硕士学位论文.