原代海马神经元培养与高内涵筛选模型制备

图1.原代海马神经元提取和高内涵药筛流程图

材料与试剂

1. 15 mL离心管 (Corning，catalog number: 430790) 
2. 50 mL离心管 (Corning，catalog number: 430828) 
3. 60 mm TC处理培养皿 (Corning，catalog number: 430166) 
4. 96孔培养板(Corning, catalog number: 3603 )
5. 6孔培养板（Corning, catalog number: 3516）
6. 细胞爬片（上海卧宏生物有限公司，catalog number: WHB-6-CS）
7. 0.22 μm滤器 (Millipore，catalog number: SLGP033RB) 
8. 20 mL注射器 (江苏华达医疗器械有限公司，catalog number: 20 mL) 
9. P0-P1乳鼠4-6只 (C57BL/6J, 上海杰思捷实验动物有限公司) 
10. Neurobasal培养基 (Gibco, catalog number: 21103-049)
11. B27添加剂 (Gibco, catalog number: 17504-044) 
12. L-谷氨酰胺 (索莱宝，catalog number: G8230) 
13. DMEM-F12 (HyClone, catalog number: SH30023.01) 
14. 青链霉素（Penicillin-Streptomycin (10000U/mL) ）(gibco, catalog number: 15140-122)
15. 木瓜蛋白酶 (生工，catalog number: A501612-0100) 
16. DNA酶（DNase I） (Acmec, catalog number: D61781)
17. 胎牛血清（Fetal bovine serum ，FBS) (Gibco, catalog number: 10099-141) 
18. 多聚赖氨酸溶液 (L型) (生工, catalog number: E607015-0005) 
19. 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline, PBS）(上海元象医疗器械有限公司, catalog number: YXB5001) 
20. 4%多聚甲醛固定液（碧云天，catalog number: P0099-100mL）
21. BODIPY581/591 C11(Thermo Fisher，catalog number: D3861)
22. Hoechst33342(生工，catalog number: E607302-0025)
23. 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）（Sigma, catalog number: D2650-100ML）
24. 雷帕霉素（selleck，catalog number: AY-22989）
25. QuickBlockTM免疫染色封闭液（碧云天，catalog number: P0260）
26. Anti-MAP2 Rabbit pAb（Servicebio，catalog number: GB1128-2）
27. Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）Fluor488-conjugated（affinity，catalog number: S0018）
28. 抗荧光淬灭封片液（含DAPI）（碧云天，catalog number: BL539A）
29. 10% 84消毒液
30. 二蒸水
31. 神经元无血清培养基 (见溶液配方)
32. 完全培养基 (见溶液配方)
33. 木瓜蛋白酶 (见溶液配方)
34. DNase I (见溶液配方)
35. BODIPY581/591储存液 (见溶液配方)
36. BODIPY581/591+Hoechst33342混合染液 (见溶液配方)
37. 雷帕霉素储存液 (见溶液配方)
38. 含雷帕霉素神经元无血清培养基梯度液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher，model: 3111型) 
2. Multidrop Combi自动分液器(Thermo Fisher，catalog number: 5840300)
3. Operetta高通量细胞成像分析系统（Perkin Eimer）
4. 70 μm滤网 (上海卧宏生物科技有限公司，catalog number: WHB-70 μm) 
5. 体式显微镜 (Nikon，model: SMZ745) 
6. 倒置生物显微镜 (Leica，model: DMi8) 
7. 超净工作台 (苏州泰安空气技术有限公司，model: SW-CJ-2FD) 
8. 细胞计数板 (MARIENFELD，model: AP-0650010) 
9. 眼科显微器械 (创微美，model: 16 CM) 
10. 制冰机 (知信仪器，model: ZX-80X)
    

实验步骤

一、实验前一天：

1. 湿热灭菌法处理解剖器械，烘干备用。
2. 多聚赖氨酸 (PLL) 包被96孔板和细胞爬片：
   1)

   准备5 mg/mL PLL原液。
   2)

   使用PBS将原液稀释为0.1 mg/mL的工作液。
   3)

   用工作液包被96孔板和装有细胞爬片的6孔板，每个孔加入100 μL（96孔板）2.5 mL（6孔板）工作液，在室温下包被30 min。
   4)

   移除PLL，用PBS洗3次，最后一次将PBS留在孔内。
   5)

   马上使用或放4 °C避光储存一周内使用，使用前吸除PBS。

1. 制备足够多的碎冰，将PBS和完全培养基4 °C预冷处理。
2. 在60 mm培养皿中用70%乙醇对6只P0乳鼠进行消毒。本实验已通过上海市第一人民医院伦理委员会审核。
3. 使用直头持针钳 (图2F) 将消毒后的乳鼠转移至含有预冷PBS的60 mm培养皿中，使用直头角膜剪 (图2B) 快速对全部乳鼠进行断头处理。
   
   
   图2. 眼科显微器械 A.弯头角膜剪。B.直头角膜剪。C.直无损伤镊 (无齿)。D.直无损伤镊 (有齿)。E.弯头持针钳。F.直头持针钳。
   
   
4. 将所有鼠头转移至含有预冷完全培养基（见溶液配方）的60 mm培养皿中，将培养皿移至体式显微镜下 (图3A)；使用直无损伤镊 (无齿) (图2C) 和直无损伤镊 (有齿) (图2D) 对鼠头进一步解剖。
   
   
   图3. 体式显微镜镜下解剖图例 A.乳鼠头部。B.剥离头皮后。C.剥离颅骨后。D.完整的脑组织。
   
   
5. 首先使用两把镊子将鼠头头皮剥离，随后可见光滑发亮质地偏硬的颅骨 (图3B)。使用有齿尖镊固定住颅骨的脑干侧，用无齿尖镊从脑干侧向鼻尖方向剥离颅骨，剥离后后可见完整的脑部结构 (图3C)。
   注释：剥离颅骨时应按照此顺序操作，以确保端脑部位的解剖结构完整性，随意剥离或从鼻侧开始剥离可能造成端脑解剖结构毁损从而导致后续的海马结构不可辨认。
6. 用镊子将完整的脑组织从颅底拨出，夹住脑干侧将之转移至放于冰上的含有完全培养基的60 mm培养皿中；重复上述操作将所有脑组织全部解离出来 (图3D)。
7. 将脑组织背侧朝上，使用弯头角膜剪 (图2A) 剪去小脑、脑干部分，随后用一把镊子固定住间脑，沿着虚线，贴着间脑剪下一侧大脑半球，同样的方法剪下另一侧 (图4A)。
   注释：此处解剖时要注意贴着间脑进行剪切，以防止损伤海马结构。
8. 将一侧大脑半球内侧朝上，可见其上有一层血管膜包被 (图4B)，使用两把镊子轻柔地将表面的血管膜游离干净后，即可清楚地见到透明度较低的月牙形海马组织 (图4C)。使用镊子或弯剪将海马游离下来，转移至放在冰上含有完全培养基的60 mm培养皿中 (图4D)。同样的手法处理另一侧大脑半球，直到将所有脑组织处理完。
   注释：血管膜一定要游离干净，否则会导致后续吹打困难和神经元纯度降低。
   
   
   图4. 海马解剖图例 A.游离大脑半球。B.包被血管膜的大脑半球。C.海马位置。D.游离出的海马组织。
   
   
9. 用弯剪将海马组织剪碎成1 mm × 1 mm左右大小的组织碎片，随后将其转入细胞房中的超净工作台中。
10. 将海马碎片组织转移至15 mL离心管中，静置1 min后吸掉上清，使用PBS洗2遍，随后加入配置好的5 mL 木瓜蛋白酶（8 mg/mL）和5 mL DNase I（2 mg/mL）溶液（见溶液配方），将离心管水平放置放入37 °C水浴锅或者细胞培养箱中进行消化25 min (图5A)。每隔5 min摇晃一次离心管，使消化更充分。
    注释：竖直放置会导致组织都聚集在管底而导致消化不充分，横置摇匀后可以使组织分散开来，加大消化效率。木瓜蛋白酶和DNase I应该提前37 °C预热或者室温放置。
    
    
    图5. A.水平放置15 mL离心管进行消化；B.吹打和过滤
    
    
11. 消化25 min后，将离心管静置1 min，小心吸除上清，轻柔地使用PBS洗2遍。随后加入4 mL完全培养基，使用1 mL 移液枪和配套枪头进行吹打。吹打时应保持轻柔，缓慢，吹打10次后，静置半分钟，吸取3 mL上清移至装有70 μm滤器的50 mL离心管中 (图5B)；随后再往15 mL离心管中补充3 mL完全培养基，再重复刚刚的吹打和移液过程；总共吹打不超过3个循环。最后可获得8 mL左右的细胞悬液。
    注释：消化完后用PBS洗涤时要注意轻柔，因为这时组织很松散；吹打一定要轻柔，防止暴力吹打导致神经元死亡；吹打时可使用抛光后的巴斯德移液管或者使用1 mL蓝枪头吹打，过大口径的枪头吹打可导致吹打不均匀，过小口径的枪头吹打容易造成神经元死亡过多；获得的细胞悬液应该通过70 μm滤器防止成团的细胞和大块组织混入其中；为防止过度吹打造成神经元死亡，应该严格按照上述方法进行分批吹打和细胞收集。
12. 将获得的细胞悬液转移至60 mm培养皿，八字摇匀后放入细胞培养箱培养1h进行差速贴壁处理。
    注释：由于非神经细胞贴壁速度快于神经元，进行差速贴壁可除去部分非神经细胞以纯化原代神经元。
13. 1 h后将60 mm培养皿取出，将上清转移至15 mm离心管，将细胞悬液混匀，取一滴放于细胞计数板在显微镜下计数 (一般1只乳鼠的海马组织可得到100万左右个神经细胞)。计数后使用完全培养基将细胞密度稀释至2 × 105 个/mL，准备进行种板。
    注释：此处的种板浓度只是参考，实际操作时具体浓度应由实验者进行摸索。
14. 先将一部分细胞以70万/孔的浓度种于6孔板的细胞爬片上，每个孔共2.5mL完全培养基，摇匀后放于细胞培养箱培养；随后使用Multidrop Combi自动分液器（简称：Multidrop）进行铺板：①开机，将分液盒组装于Multidrop上；②将输液管道放于装有50 mL 10% 84消毒液的离心管中，确保每条管道浸没在84消毒液中；③按下PRIME按键确保每个管道均有84消毒液流出，随后静置消毒10min；④继续按PRIME直到离心管内无液体后，按EMPTY清空输液管道内液体；⑤将输液管道外壁残留液滴轻甩干净，依次放入3管50 mL双蒸水和1管50mL PBS中（PBS放最后），使用PRIME按键进行洗涤，每次洗涤结束均使用EMPTY按键清空输液管道，并轻甩干管壁外液滴（图6A）；⑥清洗完管道后，将输液管道放入充分混匀的细胞悬液种，将种板参数调整为：96 standard（15 mm）+250μL Standard cassette+LOW speed（图6B、C），并选好需要加的孔（select columns+拆卸相应的输液管道）（图7），将96孔板正确放于板架上，移除板盖，按START键进行快速种板（Video1）。种板完成后，盖上孔板盖子，将96孔板放置于超净工作台上保持不动20 min。20 min后在显微镜下成像观察后，放入细胞培养箱进行培养。同时再对输液管道进行一轮②-⑤中的消毒清洗步骤。
    
    
    图6. Multidrop Combi自动分液器使用图例 A.对输液管道进行消毒；B.主要参数设定；C.加液速度设定
    
    
    图7. Multidrop Combi自动分液器加液孔选择
    
    
    
    
    Video1. Multidrop Combi自动分液器铺板视频
    
    注释：每孔使用250 μL的种板液量可减轻96孔板的弯液面效应 (图8)，使神经元不会聚集在孔的周围。20 min的静置可防止铺板不均匀和减少边缘效应 (Lundholt et al., 2003)。
    
    
    图8. 弯液面效应图例 由于96孔板孔径较小，孔周的液体表面分子受到的孔壁附着力大于分子内聚力，整体呈向孔壁移动，带动悬浮在液体中的细胞向孔壁运动；液量越少，这一现象越明显，液量越多，则该现象越不明显。
    
    
15. 培养4-6 h后，将完全培养基吸出，使用PBS洗涤1遍，随后每个孔加入100 μL（96孔板）/2.5 mL(6孔板)的神经元无血清培养基（见溶液配方），再放入细胞培养箱中继续培养。后续每3 d使用神经元无血清培养基进行半量换液，分子生物实验最好在种板后7 d内完成。
    注释：4-6 h后换液可进一步清除死细胞和细胞碎片等对神经元生长有害物质；由于96孔板孔数较多，在将完全培养基吸出和使用PBS洗涤过程中，应逐排操作，切不可让孔板在无培养基（或PBS）状态下过久，否则神经元将大量死亡；使用无血清培养可抑制胶质增生，半量换液可保留神经细胞自身分泌的营养因子，有利于神经元生长。
16. 神经元纯度分析：培养第2天时使用4%多聚甲醛室温固定6孔板中细胞爬片20min，PBS洗涤2遍，使用免疫染色封闭液室温封闭15 min，将爬片转移至载玻片上，细胞面朝上，放于湿盒中，使用兔抗鼠MAP2一抗4 °C过夜孵育，PBS洗涤3次后，37 °C避光孵育山羊抗兔荧光二抗1 h，随后再使用PBS洗涤3次，每次5min，最后使用含DAPI封片液进行封片，于荧光显微镜下观测神经元纯度（图9），可见大部分细胞均为神经元
    
    
    图9. 原代海马神经元（第2天）细胞爬片免疫荧光染色 双染结果提示（MAP2：成熟神经元标志物，绿色）（DAPI：细胞核标志物，蓝色）大部分细胞为神经元。
    
    
17. 药物处理：可在体外培养2天后进行加药处理，此时神经元形态已较为典型。本文选择使用自噬激动剂雷帕霉素作为示例探究不同浓度的雷帕霉素对原代海马神经元内脂质降解的促进作用，并证明这一高通量筛选模型的可行性。在种板后第二天，吸出96孔板中的培养基，按照排版往孔内加入含不同浓度雷帕霉素的神经元无血清培养基（1 μM、500 nM、50 nM、0.1%DMSO、Blank）后（见溶液配方），放细胞培养箱处理2 h。
18. 染色与成像：将96孔板中含雷帕霉素培养基吸出，使用4%多聚甲醛室温固定15min后，PBS洗涤两次，随后使用BODIPY581/591+Hoechst33342混合染液（见溶液配方）避光37 °C孵育20min，再使用PBS洗涤3次，最后一次将PBS留在孔内；使用Operetta高通量细胞成像分析系统进行成像与分析:每个孔可拍摄超过12个视野，记录荧光图像并同时分析出平均荧光强度，结合统计软件可快速获得定量分析结果（图10）。
    
    
    图10. 使用Operetta高通量细胞成像分析系统结果. A.原代神经元荧光图像（灰度）（100X）；B.使用prism软件对Operetta收集的荧光数据进行统计分析。
    
    
    

实验注意要点

1. 单用胰酶消化。
   胰酶消化容易导致神经元死亡过多，且死亡的细胞释放出DNA导致其他细胞缠结到一起，致使消化不充分，神经细胞成团，种板后神经元死亡。采用木瓜蛋白酶和DNase I共同消化可使消化更加高效。
2. 吹打过于暴力或吹打过度。
   吹打暴力和吹打过度都会导致神经元死亡，致使培养效果较差。要注意吹打使用的枪头大小，吹打时轻柔、分批次吹打和收集细胞，加入少量的DNase I可获得更好的吹打效果。
3. 神经元种板密度不适合。
   过高和过低的密度都会加速神经元死亡，具体的种板密度需要做预实验摸索。由于原代神经元不能增殖，且神经元间需要形成突触才能更好生长，所以种板的密度应该尽量偏高。
4. 神经元聚集在孔中间，周围没有细胞或者分布不均。
   这可能是洗涤或者加入培养基时从孔边缘冲刷细胞导致的，操作时要注意力度轻柔，贴壁滴加可避免液滴直接冲刷细胞。
5. 神经元聚集在孔周围：培养基过少导致的“弯液面效应”；或者是96孔板换液时孔内无液体状态过久，导致孔中间神经元直接暴露在空气中过久而死亡脱落，而孔周围神经元由于“弯液面”效应依然处于残留的液体中。逐排换液可有效解决这个问题。
   

结果与分析

原代海马神经元的培养历史已有几十年，从开始最经典的“Banker method” (Banker and Cowan, 1977)，到现在成熟的无血清培养；原代神经元培养既往常常采用E16.5（小鼠）、/E18.5（大鼠）胎鼠为材料，取材位置有皮层和海马，皮层细胞数量多，但神经元纯度不高，且神经元种类繁多；海马细胞相对较少，但神经元纯度高，非神经细胞也少。胎鼠海马组织较P0鼠海马组织有更高的神经元浓度，但有需要杀死母鼠、容易浪费其他胎鼠、胎鼠过少和等待孕期等缺点，不利于高效率地获得原代细胞 (Meberg and Miller, 2003; Beaudoin III et al., 2012)，而使用P0鼠为材料则在略微牺牲神经元浓度的情况下较好的解决这些问题。通过彻底剥离海马组织表面的血管膜、差速贴壁（非神经细胞贴壁速度快于神经细胞）和无血清培养等操作可以纯化神经元细胞。理论上来说，胶质细胞在神经元无血清培养基培养中增殖被抑制，但在原代神经元长期培养时（＞7d），往往要加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的增殖，但阿糖胞苷的加入也会影响神经元的活性，不利于毒理实验的研究。药物筛选实验应尽量在短期内完成，所以本文涉及的方法为短期培养，避免了阿糖胞苷的使用。既往的研究大部分是在培养皿或者6孔板中进行原代神经元培养，较少有文献使用96孔板来进行培养，结合机器进行培养的数据更为罕见。究其原因可能是原代神经元的培养条件较其他细胞苛刻，细胞分布不均或者胶质细胞污染都会对接下来的实验造成严重影响。使用96孔板培养原代神经元将有利于进行基于原代神经元为细胞模型的高通量药物筛选实验，本文结合Multidrop Combi自动分液器对原代海马神经元在96孔板中培养的条件进行了探究，并培养了分布均匀、形态良好和纯度较高的海马神经元 (图9和11)，表明了机器的剪切力对神经元生存并无太大影响，且使用Operetta高通量细胞成像分析系统对原代神经元高内涵药筛进行了初步探究。当然，本文也有不足之处：首先，Neurobasal medium是用来培养胎鼠源的原代神经元，本文使用的为P0乳鼠为提取对象，理论上应使用Neurobasal-A 培养基来进行无血清培养，但在实际操作过程中并未发现有太大影响；其次，由于实验条件受限，本文未对培养的海马神经元进行功能评价，这可能是我们未来的工作任务；最后，没有在384孔板和1536孔板中进行培养测试，但是由于孔径过小，各种操作的流程也大不一样，我们的初步实验并未获得很好的效果，这也是我们未来需要攻克的难题。



图11. 96孔板中不同时间点原代海马神经元形态

溶液配方

1. 神经元无血清培养基
   首先称取0.0731 g的L-glutamine 干粉到5 mL的Neurobasal medium中以配置浓度为100 mM的L-glutamine溶液，随后在96 mL的Neurobasal medium中加入2 mL B-27 Supplement (50x), serum free、2 mL 100 mM L-glutamine和0.5 mL的Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)；最后使用0.22 μm的滤器进行滤菌，可放于4 °C保存。
2. 完全培养基
   向90 mL的DMEM-F12培养基加入10 mL FBS和1 mL的Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)。可放于4 °C保存。
3. 木瓜蛋白酶
   取40 mg的木瓜蛋白酶干粉加入至5 mL的DMEM-F12培养基中 (8 mg/mL)，使用0.22 μm的滤器进行滤菌，可放于-20 °C保存一夜或当天使用。
4. DNase I
   取10 mg DNase I干粉加入至5 mL的DMEM-F12培养基中 (2 mg/mL)，使用0.22 μm的滤器进行滤菌，可放于-20 °C保存一夜或当天使用。
5. BODIPY581/591储存液
   使用0.992 mL的DMSO溶解1 mg BODIPY581/591干粉获得2 mM的储存液，放于-20 °C保存。
6. BODIPY581/591+Hoechst33342混合染液
   取10 μL BODIPY581/591储存液加入10 mL Hoechst33342中充分混匀。
7. 雷帕霉素储存液
   使用0.5469 mL的DMSO溶解5 mg的雷帕霉素干粉获得10 mM雷帕霉素储存液，分装后于-80℃保存。
8. 含雷帕霉素神经元无血清培养基梯度液
   含1 μM雷帕霉素：取1 μL 10mM雷帕霉素溶液加入9 μL DMSO中获得1 mM雷帕霉素溶液，再取5 μL上述混合液加入5 mL 神经元无血清培养基中；
   含500 nM雷帕霉素：取5 μL 1mM雷帕霉素溶液加入5 μL DMSO中获得500 μM雷帕霉素溶液，再取5 μL 500 μM雷帕霉素溶液加入5 mL 神经元无血清培养基中；
   含50 nM雷帕霉素：取5 μL 500 μM雷帕霉素溶液加入45 μL DMSO中获得50 μM雷帕霉素溶液，再取5 μL 50 μM雷帕霉素溶液加入5 mL 神经元无血清培养基中；
   0.1%DMSO：取5 μL DMSO加入5 mL 神经元无血清培养基中。
   

致谢

感谢中科院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的兰姝珏老师和她的团队对我工作的认可和帮助；感谢我的导师林浩东教授和中山医院的陈子贤教授、姜畅师兄对我工作的大力支持！

参考文献

1. Lundholt, B. K., Scudder, K. M. and Pagliaro, L. (2003). A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J Biomol Screen 8: 566-70.
2. Banker, G. A. and Cowan, W. M. (1977). Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res 126: 397-42.
3. Meberg, P. J. and Miller, M. W. (2003). Culturing hippocampal and cortical neurons. Methods Cell Biol 71: 111-27.
4. Beaudoin III, G. M. J., Lee, S. H., Singh, D., Yuan, Y., Ng, Y. G., Reichardt, L. F. and Arikkath, J. (2012). Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat Protoc 7: 1741-54.