Screening Regulatory factors for Production of Cytoplasmic C hromatin Fragments by Immunofluorescence

材料与试剂

1. 384孔板（品牌：ViewPlate，货号：6007460）
2. 胎牛血清（品牌：NTC，货号：SFBE）
3. DMEM/HIGH GLUCOSE（品牌：Hyclone，货号：SH30022.01）
4. MEM NEAA（100×）（品牌：Gibco，货号：11140-050）
5. GlutaMAX（100×）（品牌：Gibco，货号：35050-061）
6. 0.25% Trypsin-EDTA（1×）（品牌：Gibco，货号：25200-056）
7. Penicillin-Streptomycin Solution（品牌：Hyclone，货号：SV30010）
8. Opti-MEM（1×）（品牌：Gibco，货号：31985-070）
9. H3K9me3抗体（品牌：Abcam，货号：ab8898）
10. rH2AX抗体（品牌：Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-517348）
11. Alexa Fluor 568 goat anti- rabbit IgG（H+L）（品牌：Invitrogen，货号：A11011）
12. Alexa Fluor 488 goat anti- mouse IgG（H+L）（品牌：Invitrogen，货号：A11001）
13. DAPI（品牌：碧云天，货号：C1002）
14. Triton X-100（品牌：碧云天，货号：ST795）
15. Tween-20（品牌：碧云天，货号：ST825）
16. 10× PBS 缓冲液（品牌：BBI，货号：E607016-0500）
17. 4%组织固定液（广州晶欣生物科技有限公司，货号：JX0100）
18. 即用型正常山羊血清（品牌：博士德生物，货号：AR009）
19. Dharma FECT1 Transfection Reagent（品牌：Dharmacon，货号：T-2001-01）
20. 5×siRNA Buffer（品牌：Dharmacon; 货号：B-002000-UB-100，使用时用去离子水稀释为1×siRNA Buffer）
21. 全基因组siRNA试剂（Human ON-TARGET plus siRNA Library-Genome-SMARTpool，货号G-105005-E2-025）
22. 培养IMR90细胞的培养基（见溶液配方）
    

仪器设备

1. Multidrop Combi 自动分液器（Thermo Fisher Scientific）
2. Blue Washer洗板机
3. Operetta高内涵成像分析仪
   
   仪器如图： 
   
   
   
4. 水平离心机
   

实验步骤

一、全基因组siRNA文库转染
经过预实验的多次优化，确定最适转染条件为：在384孔板中，使用Dharma FECT1 Transfection Reagent 0.075 μl /孔，细胞接种密度2,000个/孔，转染72 h后进行表型检测。
siRNA转染的具体操作步骤如下：

1. 转染对照siRNA的制备：
   siRNA筛选实验中完整的对照系统应包括：转染对照、阳性对照、阴性对照、空白对照。
   1. 使用1× siRNA buffer 分别稀释Non-targeting Pool siRNA（阴性对照）、Tox（转染对照）及经过多次验证的可信的阳性siRNA至0.1 μM；
   2. 将各对照siRNA加入对应孔内，每孔10 μl；
2. 转染试剂的制备：
   1. 按照7.5 μl/ml的浓度，将Dharma FECT1 Transfection Reagent稀释在Opti-MEM中；
   2. 使用自动化分液仪Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入siRNA板内（第2列至第23列，货号G-105005-E2-025），10 μl /孔；
   3. 水平离心机129 x g离心，2 min，将siRNA与Dharma FECT1混匀；
   4. 室温静置20 min；
3. 细胞悬液的制备：
   1. 用DMEM完全培养基将IMR90细胞（p10-p15代次）密度调整为67,000/ml；
   2. 使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述细胞悬液加入siRNA板（第2列至第23列，货号G-105005-E2-025）30 μl /孔；
   3. 为减少边缘效应，在384孔板第1列及第24列加入50 μl 1× PBS或 DMEM；
   4. 将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机129 x g离心2 min，放置于CO₂培养箱中，培养72 h。

1. 固定：在孔内直接加入16% PFA（4×）室温固定20 min，吸去固定液然后用PBS洗3 min;
2. 通透：PBS-TritonX100（0.5%）通透25 min，吸去通透剂而后加入PBS洗3 min；
3. 使用即用型正常山羊血清按照1:2,000稀释一抗，每孔15 μl，4 °C过夜；
4. PBST(Tween20, 0.1%)洗一抗，洗三次，15 min/每次；
5. 使用即用型正常山羊血清按照1:2,000稀释二抗，每孔15 μl，室温孵育2小时；
6. PBST(Tween20, 0.1%)洗二抗，洗三次，15 min/每次；
7. DAPI(1 mg/ml), 用PBS稀释DAPI(1:1,500)，每孔15 μl，室温孵育30 min，PBS洗10 min，孔里加入PBS后应用高内涵仪器进行拍照。转染前细胞状态图片，转染siRNA后65 h细胞状态如图1所示；相对应的免疫荧光图片如图2所示。
   
   转染前照片：
   
   转染后照片：
   
   图1. 转染siRNA前后IMR90细胞状态
   
   
   图2. 转染siRNA后进行免疫荧光染色后的代表性照片
   拍照图片：（左侧为转染Control siRNA结果，右侧图为转染BLM基因 siRNA结果，绿色通道为rH2AX蛋白，红色通道为H3K9me3蛋白，蓝色通道为DAPI）
   
   
8. 分别计算DAPI、rH2AX和H3K9me3单阳性及三阳性的胞质染色质片段数目，并并计算三阳性的胞质染色质片段数目占细胞总数百分比，找出百分比具有明显变化的基因。

溶液配方

1. 培养IMR90细胞的培养基
   90% DMEM
   10% FBS
   1% MEM NEAA
   1% GlutaMAX
   1% Penicillin-Streptomycin Solution
   siRNA转染前给IMR90细胞换上新鲜的培养基中不添加Penicillin-Streptomycin Solution。
   

参考文献

1. Chien, Y., Scuoppo, C., Wang, X., Fang, X., Balgley, B., Bolden, J. E., Premsrirut, P., Luo, W., Chicas, A., Lee, C. S., Kogan, S. C. and Lowe, S. W. (2011). Control of the senescence-associated secretory phenotype by NF-kappaB promotes senescence and enhances chemosensitivity. Genes Dev 25(20): 2125-2136.
2. Ivanov, A., Pawlikowski, J., Manoharan, I., van Tuyn, J., Nelson, D. M., Rai, T. S., Shah, P. P., Hewitt, G., Korolchuk, V. I., Passos, J. F., Wu, H., Berger, S. L. and Adams, P. D. (2013). Lysosome-mediated processing of chromatin in senescence. J Cell Biol 202(1): 129-143.
3. Dou, Z., Xu, C., Donahue, G., Shimi, T., Pan, J. A., Zhu, J., Ivanov, A., Capell, B. C., Drake, A. M., Shah, P. P., Catanzaro, J. M., Ricketts, M. D., Lamark, T., Adam, S. A., Marmorstein, R., Zong, W. X., Johansen, T., Goldman, R. D., Adams, P. D. and Berger, S. L. (2015). Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527(7576): 105-109.
4. Wiley, C. D., Velarde, M. C., Lecot, P., Liu, S., Sarnoski, E. A., Freund, A., Shirakawa, K., Lim, H. W., Davis, S. S., Ramanathan, A., Gerencser, A. A., Verdin, E. and Campisi, J. (2016). Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab 23(2): 303-314.
5. Liu, H., Zhang, H., Wu, X., Ma, D., Wu, J., Wang, L., Jiang, Y., Fei, Y., Zhu, C., Tan, R., Jungblut, P., Pei, G., Dorhoi, A., Yan, Q., Zhang, F., Zheng, R., Liu, S., Liang, H., Liu, Z., Yang, H., Chen, J., Wang, P., Tang, T., Peng, W., Hu, Z., Xu, Z., Huang, X., Wang, J., Li, H., Zhou, Y., Liu, F., Yan, D., Kaufmann, S. H. E., Chen, C., Mao, Z. and Ge, B. (2018). Nuclear cGAS suppresses DNA repair and promotes tumorigenesis. Nature 563(7729): 131-136.
6. Vizioli, M. G., Liu, T., Miller, K. N., Robertson, N. A., Gilroy, K., Lagnado, A. B., Perez-Garcia, A., Kiourtis, C., Dasgupta, N., Lei, X., Kruger, P. J., Nixon, C., Clark, W., Jurk, D., Bird, T. G., Passos, J. F., Berger, S. L., Dou, Z. and Adams, P. D. (2020). Mitochondria-to-nucleus retrograde signaling drives formation of cytoplasmic chromatin and inflammation in senescence. Genes Dev 34(5-6): 428-445.