单晶衍射仪晶体数据收集与处理

材料与试剂

1. 溶菌酶晶体
2. 防冻液 (由晶体池液母液与防冻剂组成，防冻剂如甘油、乙二醇)
3. Loop (迅晶生物)
4. 捞晶体杆 (迅晶生物)
5. 液氮
   

仪器设备

1. 单晶衍射仪 (Rigaku，model: XtaLAB Synergy FRX)
2. 显微镜 (Nikon，model: SMZ1270)
   

实验步骤

一、仪器准备
晶体直接暴露在x-ray的照射下，在极短的时间内，晶体内部的排列顺序就会受到破坏而无法获得足够的衍射数据，因此需要一些手段保护晶体，研究发现当晶体处于极低温的环境中，可以延长晶体暴露于x-ray的时间，维持内部分子的排列顺序。晶体衍射之前，需要RIigaku 单晶衍射仪用液氮降温至100 K，电压升至45 KV，电流升至66 mA。

二、晶体衍射筛选

1. 配防冻液
   直接低温冷却会使晶体内部产生冰晶，以至于破坏蛋白晶体内部的有序结构，所以要选择合适的防冻液，因此防冻液成为晶体实验学中不可或缺的重要一环。合适的防冻液以不产生冰环为佳。防冻液的组成为晶体生长条件添加终浓度约15%-30%防冻剂，常用的防冻剂有甘油、乙二醇和小分子PEG等 (Pflugrath, 2015)。
2. 捞晶体
   Loop环借助于表面张力将液滴中的晶体固定于loop环中。晶体尺寸较小，只有在显微镜下才可以清晰观察到。选取液滴中较大且表面相对光滑的晶体 (参见图1与图2) 进行衍射。根据晶体的大小选用稍大于晶体尺寸的loop环在显微镜下捞取晶体。
   
   
   图1. 晶体A
   
   
   图2. 晶体B
   
   
3. 晶体对心调整。
   将晶体放置到载晶座上，注意不要碰到准直管、低温喷嘴，挡光器与摄像头 (参见图3标注)。软件的操作处于mount界面，crystal video 窗口的十字中心位置为光斑的中心，根据光斑的位置来调整晶体的位置，使晶体对准光斑的正中心，并且载晶座以Phi轴 (参见图3) 为对称轴旋转360度依然可以使光斑的中心对准晶体 (参见图4与图5)。
   
   
   图3.衍射仪的衍射几何
   
   
   图4. 晶体对心图A
   
   
   图5. 晶体对心图B
   
   
4. 初步设置晶体衍射条件
   具体包括选择曝光时间、衍射分辨率、探测器到晶体的距离与扫描宽度。与同步辐射相比，室内机光强度较弱，可以先选择10-30 s衍射一张。初步测试，可以选择2.0-3.0埃分辨率 (探测器到晶体的距离一般选择不低于35 mm), 扫描宽度选择1度一张。点击界面中的start完成衍射。衍射图中标有衍射分辨率环，可以根据肉眼可见的衍射点所在位置和衍射率环上标注的分辨率大概判断出晶体的衍射分辨率。载晶座上的晶体围绕Phi轴转90度后再打一张衍射图，看不同角度晶体的衍射质量与分辨率。
5. 衍射条件优化
   高质量的衍射点清晰圆润、无拖尾、无成环，尽可能少的折叠。根据初步筛选衍射图中衍射点的质量和衍射分辨率来进一步调整衍射的参数。
   设置的最高分辨率，尽可能收集到晶体衍射的极限范围。常用的策略是将分辨率设置为能够收集到肉眼可见分辨率的最外壳层再提高0.2埃。
   调节收集探测器和晶体的距离以及合适的扫描宽度，尽可能地将相邻衍射点分散开，避免衍射点重叠。若稍有点重叠情况，可以尝试加大探测器和晶体的距离。根据晶体的晶胞大小来调整扫描宽度，若是晶胞比较大，或者单个轴长超过100埃，可以减小扫描宽度到0.5度每张或者0.25度每张，以降低衍射点重叠。
   选择合适的起始角度，尽量在较小的辐射剂量条件下收集到完整的数据。
   选择合适的曝光时间，提高信噪比同时避免晶体衍射能力过快衰老(参见图6与图7)。
   
   
   图6. 晶体10 s的衍射效果
   
   
   图7. 晶体30 s的衍射效果
   
   
   

三、数据收集
每一张衍射图，仪器软件会自动处理并给出晶胞参数与指标化率。指标化率是指可以被指标化的衍射点占总点数的百分比，也可以理解为当前晶胞与已收集到的所有衍射点的吻合程度，是晶体质量的一个重要评估指标。建议挑选指标化率高于70%的晶体收集完整数据。如果达到比较高的分辨率如3.5埃以上，且衍射点的质量比较好，可以进行下一步的数据收集。
此时有两种收集方式可以选择：自动收集和自定义收集。自动收集是根据衍射筛选后的结果，设置的目标分辨率 (设定所采集数据的最高分辨率)、完整度以及信噪比、冗余值 (Rudundancy) 等计算出收集数据的策略和实验所需要的时间。自定义收集，可以根据优化后衍射的条件设置曝光时间、衍射分辨率、探测器到晶体的距离与扫描宽度，并根据自动处理的空间群的对称性选择收集的角度。

四、数据处理
在数据收集的过程中，CrysAlisPro软件会自动进行数据处理，数据收集结束后自动生成mtz格式文件，通过ccp4软件进行下一步的结构解析。

结果与分析

晶体的衍射质量与分辨率因晶体种类与长晶条件不同而相差较大，甚至同一液滴中的晶体衍射也有差别，晶体的外观不能反映出晶体的衍射质量与其分辨率，只有通过衍射仪，我们才可以判断这颗晶体的衍射质量及其能达到的最高分辨率。进一步通过数据收集与结构解析，最终得到晶体的三维结构。
如果晶体堆积原因造成晶体的衍射质量差、分辨率差 (参见图8与图9) 或者收集了数据难以解析出结构，只能通过不断的晶体优化和衍射测试，直到收集到的数据可以解析出结构。


图8. 衍射分辨率差的晶体衍射图


图9. 衍射分辨率稍差的晶体衍射图

失败经验

1. 防冻液的选择需要实验人员根据经验和实际情况多次摸索，不合适的防冻液会在晶体表面形成明显的冰晶，衍射图中产生冰环 (参见图10)。另外防冻液不能太多，太多会影响晶体样品对心。
   
   
   
   图10.有冰环的晶体衍射图
   
   
2. 晶体数据收集需要固定好晶体的位置，收集过程晶体位置移动，有可能会导致结构难以解析。
3. 关注液氮剩余量，及时向液氮储存罐中添加液氮。一旦液氮剩余量不足，会使晶体照死，导致晶体失去衍射能力。
4. 关注衍射点重叠预测值
   尽量降低衍射点的重叠率，减小扫描宽度和增大检测器到样品的距离都能改善衍射点重叠现象。
   

致谢

本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。本文得到理学电企仪器（北京）有限公司Rigaku应用支持专家李宁的帮助。

参考文献

1. Pflugrath, J.W. (2015). Practical macromolecular cryocrystallography. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 71(Pt 6): 622-642.