Protein-Protein Interaction Detection Method-AlphaScreen Technology

材料与试剂

1. 384孔板 (Corning, catalog number: 3712)
2. 384 well Roche Plate (TTP)
3. Nickel Chelate AlphaLISA Acceptor Beads (Perkin Elmer, catalog number: AL108M)
4. AlphaScreen Streptavidin Donor beads (Perkin Elmer, catalog number: 6760002)
5. 牛血清白蛋白 (BSA) (Sigma, catalog number: V900933-100G100 G)
6. DPBS，无钙、无镁 (GBICO, catalog number: 14190250) 
7. OptiPlate (384-well, white) (Perkin Elmer, catalog number: 6007290)
8. AlphaScreen Buffer (见溶液配方)
   

仪器设备

1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher, model: Multidrop Combi)
2. Bravo自动化液体处理平台 (Agilent, model: Bravo)
3. Mosquito自动化液体工作站 (Labtech TTP, model: Mosquito LV) 
4. Envision多标记微孔板检测仪 (Perkin Elmer, model: Envision)
5. 多孔板离心机 (Eppendorf, model: 5810 R)
   

实验步骤

实验体系：

1. 蛋白稀释
   1.1

   His-Survivin蛋白稀释至1 μM。His-Survivin 蛋白溶液初始浓度为530 μM，取7.6 μl His-Survivin 蛋白溶液于4 ml AlphaScreen Buffer 中上下颠倒混匀。
   1.2

   Biotin-Borealin蛋白稀释至0.4 μM。Biotin-Borealin 蛋白溶液初始浓度为5.5 μM， 取290.7 μl Biotin-Borealin 蛋白溶液于4 ml AlphaScreen Buffer 中上下颠倒混匀。
2. 将蛋白加入384孔板中
   2.1

   准备Multidrop分液仪
   由于本实验体系较小，选用standard cassette进行分液操作。在分液前用10% bleach、超纯水、AlphaScreen Buffer依次对管路进行冲洗，保证管路的无菌及通畅。
   
   2.2

   蛋白铺板 (OptiPlate (384-well, white))

   1)

   准备AlphaScreen Buffer 5 ml，在384孔板的col 23-24中每孔加入5 μl AlphaScreen Buffer。

   2)

   在384孔板的col 1-24中每孔加入5 μl稀释好的Biotin-Borealin蛋白溶液。

   3)

   在384孔板的col 1-22中每孔加入5 μl稀释好的His-Survivin 蛋白溶液。

   4)

   将384孔板盖好板盖，以1000 rpm离心1 min后，等待化合物处理。
3. 化合物处理
   化合物母液以1 mM的浓度保存于DMSO中，细胞板中化合物的最终浓度为10 μM，总共需要100倍稀释。
   3.1

   应用Bravo自动工作站从化合物母板中转移3.5 μl化合物置于Roche 板中，并以相同的方式转移3.5 μl DMSO置于另一块Roche 板中。
   3.2

   应用Mosquito 液体工作站从Roche板中转移200 nl 化合物于384孔板的col 3-22中，转移200 nl DMSO于384孔板的col 1-2和col 23-24中。
   3.3

   将化合物处理过的384孔板1000 rpm 离心1 min，置于室温避光孵育1 h。
4. 向384孔板中加入Acceptor Beads
   4.1

   Acceptor Beads 稀释至80 μg/ml：Acceptor Beads溶液初始浓度为5 mg/ml，取64 μl AcceptorBeads溶液于4 ml AlphaScreen Buffer 中上下颠倒混匀。
   4.2

   在384孔板的col 1-24中每孔加入5 μl稀释好的Acceptor Beads溶液。
   4.3

   将384孔板1000 rpm 离心1 min，置于室温避光孵育1 h。
5. 向384孔板中加入Donor Beads
   5.1

   Donor Beads 稀释至80 μg/ml：Donor Beads溶液初始浓度为5 mg/ml，取64 μl Donor Beads溶液于4 ml AlphaScreen Buffer 中上下颠倒混匀。
   5.2

   在384孔板的col 1-24中每孔加入5 μl稀释好的Donor Beads溶液。
   5.3

   将384孔板1000 rpm 离心1 min，置于室温避光孵育1 h。
6. Envision 读板
7. Envision读板参数设置如图2-图5所示：
   
   
   图2. Envision 软件中AlphaScreen试验的通用设置参数页面
   
   
   图3. Envision 软件中AlphaScreen试验结果输出设置参数页面
   
   
   图4. Envision 软件中AlphaScreen读板区域的选择页面
   
   
   图5. Envision 软件中AlphaScreen读板方法的选择页面
   
   按照图示中的参数设置方法，进行读板，读板结果以html格式导出后复制到Excel中进行分析。
   

实验注意要点

1. 在使用Multidrop Combi自动分液器前注意观察各个分液头液体的分液速度是否相同，是否存在分液头堵塞的现象，最好每次使用前对分液头进行反冲，以确保分液头的通畅。
2. 在向多孔板中加入Beads时以及孵育时注意严格避光，可以用锡箔纸将384孔板的板盖包住以保证严格避光。
3. 为验证试验体系中光信号是由于目标蛋白的特异性结合引起的，可以在筛选前应用此体系以其中一个目的蛋白和已知与之没有相互作用的蛋白进行测试，确认荧光信号来源于目标蛋白之间的相互作用。
4. AlphaScreen筛选到的蛋白-蛋白相互作用抑制剂，可能是由于化合物干扰了Accept Beads发光的化学反应而产生的假阳性，第一轮筛选后可以对候选化合物应用于Biotin-His6 Linker体系中进行反筛验证。
   

结果与分析

1. Envision读板结果以Excel格式导出。
2. 数据分析：
   2.1

   分别计算阳性对照和阴性对照的平均值 (X ̅pos，X ̅neg)、标准差 (σ_pos，σ_neg)、变异系数CV%及整板的Z-factor。
   
   2.2

   计算每个孔样品的抑制率：
   
   设定某阈值如抑制率大于50%作为阳性化合物的标准，则通过计算每个化合物的抑制率，即可挑选出阳性化合物分子。

溶液配方

1. AlphaScreen Buffer
   1x PBS Buffer (pH 7.4) with 1 mg/ml BSA
   精确称量100 mg BSA 于100 ml 1x PBS Buffer (pH 7.4) 溶液中充分溶解，溶液通过0.22 μm PVDF膜过滤后于-20 °C保存，有效期1个月。
   

致谢

本课题得到了国家科技部 (2014CB910601)、国家自然科学基金 (31400796、31401206、31630044、31501111)、中国科学院青年创新促进会，上海市科学技术委员会 (14XD1404200) 的资助。感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学平台提供的技术支持和指导。

参考文献

1. Yue, L., Li, L., Li, D., Yang, Z., Han, S., Chen, M., Lan, S., Xu, X. and Hui, L. (2017). High-throughput screening for Survivin and Borealin interaction inhibitors in hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 484(3): 642-647.