High-throughput Screening Small Molecule Inhibitors of Enzyme by Reporter Gene System

图1. 筛选实验总流程.

材料与试剂

1. 96孔板 (Costar, catalog number：3879)
2. 384孔板 (Corning, catalog number：3764)
3. 384-Roche plate (TTP)
4. ABgene 384-0781 (ABgene) 
5. Countess^TM 细胞计数腔室载玻片 (Thermofisher, catalog number：C10228)
6. DMEM培养基 (HyClone)
7. Opti-MEM (Gibco)
8. 0.25% Trypsin (Invitrogen)
9. FugeneHD (Promega)
10. DMSO (sigma)
11. CellTiter-Glo (Promega) 
12. 化合物 (由中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台提供) 
13. DMEM完全培养基(见溶液配方)
    

仪器设备

1. Multidrop自动分液器 (Thermofisher,model number：Multidrop Combi)
2. Bravo自动化液体处理平台(Agilent,model number：Bravo)
3. 离心机 (Eppendorf,model number：5810R)
4. Incucyte活细胞长时间动态影像成像分析仪 (Essen BioScience, model number：Incucyte FLR)
5. Mosquito (Labtech TTP) 
6. 细胞计数仪(BodBoge, model number：JSY-SC-022)
7. 多标记微孔板检测仪(PerkinElmer,model number：Envision)
   

实验步骤

一、报告基因系统单浓度筛选酶活抑制剂
通过将GFP报告基因质粒、Notch基因表达质粒和羟化酶表达质粒瞬时共转染HEK293T细胞，待基因表达后加入待测小分子化合物，并利用Incucyte仪器长时间记录细胞中GFP荧光强度变化，以获取Notch信号通路驱动的GFP表达情况，间接反应小分子化合物对羟化酶介导的Notch信号通路活化的抑制效果，筛选有效Hits。当小分子化合物抑制羟化酶后，Notch蛋白被切割产生活化转录因子的效率下降，由该转录因子驱动的GFP报告基因表达则同时减弱；当小分子化合物对羟化酶无抑制作用时，Notch蛋白可以在蛋白酶的帮助下顺利产生大量活性转录因子，从而驱动GFP表达。本实验中初筛设置为384孔板单孔单浓度的筛选模式，得到初步阳性化合物之后将这些化合物进行一次2复孔单浓度的重复实验，以确认筛选结果。

1. 细胞的转染
   本次实验中羟化酶表达质粒，Notch表达质粒和GFP报告基因表达质粒三种质粒的转染总量为90 ng，比例为39:39:12；质粒总量 (ng) 和转染试剂 (nl) 的比例是1:3。具体的转染条件需根据课题不同进行体系优化及验证后确认。
   1.1

   消化细胞并计数

   1)

   弃掉旧培养液，在培养皿中加入5 ml PBS，晃动培养皿使PBS均匀覆盖整个培养皿后弃掉PBS以去除残留培养液。

   2)

   培养皿中加入1 ml胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，37 °C静置1 min，使细胞从培养皿上解离下来。

   3)

   培养皿中加入2 ml DMEM完全培养液，终止Trypsin消化，反复吹打细胞成单个细胞。

   4)

   将消化后的细胞离心2 min，129 × g，弃去上清，加入DMEM完全培养液重悬。

   5)

   另取一只1.5 ml EP管加入900 μl DMEM完全培养液，向其中加入100 μl细胞反复吹打混匀，用细胞计数仪进行细胞计数。

   6)

   根据计数结果用DMEM完全培养液稀释细胞，调整细胞浓度。
   1.2

   细胞铺板
   细胞铺板借助于Multidrop Combi，选用standard cassette，每孔7 x 10³个细胞，50 μl。

   1)

   准备Multidrop (需在超净台中操作)
   Multidrop 安装好standard cassette后先将管道放入含bleach的容器中prime 50 ml 10% bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的另一端转移至含ddH₂O的容器中，分三次prime，总共prime 200 ml ddH₂O以除去10% bleach。

   2)

   细胞铺板
   将standard cassette的另一端转移至含PBS的容器中prime 50 ml PBS 后进行细胞铺板，每孔加入50 μl细胞。

   3)

   将384孔板离心1 min，129 × g，置于37 °C培养箱中培养过夜，使其贴壁。
   1.3

   细胞转染

   1)

   将质粒从-20 °C移至室温解冻，转染试剂FugeneHD从4 °C移至室温平衡。

   2)

   根据质粒质量 (ng)：脂质体体积 (nl) = 1:3以及加入细胞板的混合物中质粒和脂质体的体积比1:1计算所需质粒和脂质体的总用量。

   3)

   用温浴过的Opti-MEM分别稀释质粒和脂质体FugeneHD。

   4)

   按照体积比1:1混合稀释好的质粒和脂质体FugeneHD。

   5)

   将混合物用移液器分装至96孔板中，第2-11列加阳性组混合物，第1和12列加对照组混合物。

   6)

   利用Bravo液体工作站从96孔板中转移混合物至384孔细胞板中，每孔10 μl，96孔板第2-11列加在384孔板的第3-22列，96孔板第1和12列分别加在384孔板的第1-2、23-24列。室温离心，129 × g，2 min，然后置于培养箱中培养。
2. 细胞药物处理
   绝大部分化合物溶解在100% DMSO中，储存浓度为10 mM，以96孔板 (Costar.3879) 模式保存在-80 °C冰箱。室温平铺解冻，注意避光。解冻后离心129 × g，2 min。384孔板细胞反应体系中化合物的终浓度为10 μM，所以总共需要稀释1000倍，稀释过程分两步完成。
   2.1

   化合物的100倍稀释

   1)

   准备Multidrop
   Multidrop 安装好standard cassette后先将管道放入含bleach的容器中prime 50 ml 10% bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的另一端转移至含ddH₂O的容器中，分三次prime，总共prime 200 ml ddH₂O以除去10% bleach。
   

   2)

   分配DMEM培养液
   将standard cassette的另一端转移至装有DMEM培养液的容器中prime少量体积后，向化合物板的2-11列中每孔加入100 μl DMEM培养液，第1列及第12列中每孔加入100 μl含1% DMSO的DMEM培养液。
   
   2.2

   化合物的10倍稀释
   转染4-6 h后利用Bravo液体工作站将稀释至100 µM的化合物转移至384孔细胞板中，每孔5.6 μl，室温离心，129 × g，2 min。化合物终浓度为10μM。
   
3. 信号检测
   加入化合物后将384孔细胞板放进Incucyte仪器中每6 h拍照一次，收集在化合物处理下细胞产生的GFP荧光信号。Incucyte仪器设置参数如图2。
   
   
   图2.Incucyte仪器设置参数.
   
   Tray Type：选择载体类型，如微孔板、载玻片
   Vessel Type：选择孔板类型
   Scan Type：选择拍照参数类型，如fluorescence&Phase contrast
   Scan Pattern：选择微孔板需拍照的范围
   Set Timeline Scan Intervals：选择拍照开始时间以及间隔时间
   设置好各参数一定点击Apply进行确认并开始。
4. 重复实验
   根据抑制率的计算，划定50%的阈值，将得到的初步阳性结果中所有化合物汇集在新的96孔板中，按照2复孔的模式重复一次上述实验进行结果验证，剔除假阳性化合物。
   
   
   

通过初筛鉴定出了能够抑制羟化酶激活Notch的阳性Hits，在该酶高表达的3株肿瘤细胞和HEK293T中设置一系列浓度梯度进行IC50 值的测定。每个化合物设置10个浓度，最高浓度为40 μM，2倍稀释。

1. 制作细胞接种密度的标准曲线
   1.1

   按照每孔0、500、1,000、2,000、3,000、4,000、6,000、8,000、12,000、16000、24,000细胞数目接种细胞在384孔板中，各6个复孔，每孔50 μl。
   1.2

   在37 °C、5% CO₂饱和湿度的培养箱培养6-8 h。
   1.3

   待细胞贴壁后加入CellTiter-Glo试剂，每孔20 μl，室温离心2 min，129 × g。
   1.4

   避光条件下孵育10 min，使细胞完全裂解，然后用多标记微孔板检测仪Envision的超敏化学发光模块检测化学发光信号。
   1.5

   制作标准曲线并进行线性回归，划定使R²接近1的阈值，判断CellTiter-Glo试剂对应每孔细胞数目的检测上限，同时结合细胞生长速度和细胞大小推导细胞起始接种密度范围，确定微孔板中合适的细胞接种量。
2. 接种细胞
   2.1

   消化细胞并计数

   1)

   弃掉旧培养液，在培养皿中加入5 ml PBS，晃动培养皿使PBS均匀覆盖整个培养皿后弃掉PBS以去除残留培养液。

   2)

   培养皿中加入1 ml胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，37 °C静置1 min，使细胞从培养皿上解离下来。

   3)

   培养皿中加入2 ml DMEM完全培养液，终止Trypsin消化，反复吹打细胞成单个细胞。

   4)

   将消化后的细胞离心2 min，129 × g，弃去上清，加入DMEM完全培养液重悬。

   5)

   另取一只1.5 ml EP管加入900 μl DMEM完全培养液，向其中加入100 μl细胞反复吹打混匀，用细胞计数仪进行细胞计数。

   6)

   根据计数结果用DMEM完全培养液稀释细胞，调整细胞浓度。
   2.2

   细胞铺板
   细胞铺板借助于Multidrop Combi，选用standard cassette，

   1)

   准备Multidrop (需在超净台中操作)
   Multidrop 安装好standard cassette后先将管道放入含bleach的容器中prime 50 ml 10% bleach，之后将standard cassette的管路在充满10% bleach的状态下浸泡5 min，随后将standard cassette的另一端转移至含ddH₂O的容器中，分三次prime，总共prime 200 ml ddH₂O以除去10% bleach。
   

   2)

   细胞铺板
   将standard cassette的另一端转移至含PBS的容器中prime 50 ml PBS 后进行细胞铺板，每孔加入50 μl细胞悬液。所选肿瘤细胞尺寸较大，所以每孔接种1.5 x 10³个细胞；293T细胞较小，所以每孔接种3 x 10³个细胞。
   

   3)

   将384孔板离心1min，129 × g，置于37 °C培养箱中培养过夜，使其贴壁。

   
   
3. 细胞药物处理
   3.1

   DMSO的分装

   1)

   在ABgene 384-0781微孔板的第1列手动加入50 μl 100% DMSO。

   2)

   用Mosquito仪器将ABgene 384-0781微孔板第一列的DMSO分装至Roche384孔板的4-12列，每孔1.2 μl。
   3.2

   化合物的连续稀释

   1)

   从化合物板中挑出初筛得到的阳性Hits，手动重新排布在384-Roche plate中第3列，化合物浓度为10 mM，每孔5 μl。

   2)

   用Mosquito仪器从第3列吸1.2 μl至第4列，进行mix吸打混匀。

   3)

   用Mosquito仪器从第4列吸1.2 μl至第5列，进行mix吸打混匀。循环上述操作至第12列，完成化合物浓度连续稀释。
   3.3

   化合物的加样
   利用Mosquito仪器将完成连续稀释的化合物整板转移至细胞板中，每孔200 nl，每个化合物每个浓度2复孔，室温离心，129 × g，2 min，置于培养箱中培养72 h。
   
4. 信号检测
   4.1

   用自动分液器Multidrop每孔加入20 μl CellTiter-Glo试剂，室温离心2 min进行混匀，129 × g。
   4.2

   避光条件下孵育10 min，使细胞完全裂解，然后用多标记微孔板检测仪Envision的超敏化学发光模块检测化学发光信号。
5. IC50曲线拟合
   利用GraphPad Prism软件进行四参数的曲线拟合，得到IC50值。

注意事项

1. 多质粒转染系统需要在预实验阶段优化转染条件，例如质粒之间摩尔比，每孔转染质粒总量，转染混合物体积与细胞培液体积比等。
2. 转染前384孔板中接种的细胞密度应根据细胞转染效率进行优化选择。
3. 利用CellTiter-Glo试剂进行细胞增殖实验前，要仔细判断合适的细胞接种密度，需要考虑因素如下：通过制作标准曲线来确认试剂对不同细胞株，在每个孔细胞数目的线性检测上限；同时观察比较细胞生长速度和细胞大小；还要考虑化合物处理时微孔板中细胞覆盖度应为30-50%。
4. 进行转染操作的细胞传代次数 (≤ 10) 应尽量少，同时注意培养时细胞不能长得过满，否则影响转染效率。
5. 转染时细胞培养液中不含抗生素，否则影响转染效率。
6. 化合物一般以10 mM储存在100% DMSO中，从DMSO相到水相的稀释比例不低于1:100，以保证化合物的充分溶解。
7. 细胞水平荧光信号的检测，优先选择黑色板进行实验，底部透明有利于观察细胞状态。
   

结果与分析

IncuCyte拍照的结果应用IncuCyte 2011A软件进行分析：
分析参数的设置如图3。


图3. Incucyte仪器分析参数的设置.

软件分析结束后，将Confluence和object summed intensity per mm²两个参数以384孔板排列的方式导出。
每孔的平均荧光强度
将所有对照孔的平均荧光强度求平均数，记为X_control。
每个化合物的荧光抑制率
设定某阈值如抑制率大于50%作为阳性化合物的标准，则通过计算每个化合物的荧光抑制率，即可挑选出阳性化合物分子。

溶液配方

1. DMEM完全培养基：DMEM高糖培养基 + 10%胎牛血清

致谢

感谢中国科学院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台的支持。

参考文献

1. Platonova, N., Parravicini, C., Sensi, C., Paoli, A., Colombo, M., Neri, A. and Eberini, I. (2017). Identification of small molecules uncoupling the Notch::Jagged interaction through an integrated high-throughput screening. PLoS one 12(11): e0182640.