Screening of E3 Ubiquitin Ligase that Regulates RANKL Degradation

图1. 筛选流程示意图

材料与试剂

1. 384孔板 (PerkinElmer, ViewPlate-384 F TC, catalog number: 6007460)
2. Mouse siGenome全基因组siRNA文库之Ubiquitin Conjugation Subset化学生物学技术平台的整库筛选类siRNA文库购自Dharmacon品牌，以SMARTpool的形式保存于384孔板中，每条基因的对应孔位中同时含有4条不同序列的siRNAs (SMARTpool试剂)，从而保证产生高效的基因沉默效果。我们使用其中与泛素化相关的亚文库：
   Ubiquitin Conjugation Subset 1：包含针对小鼠Cullin、E1、E2、HECT E3 Ligases等79个基因的siRNA亚文库。
   Ubiquitin Conjugation Subset 2：包含针对小鼠F-box和SOCS box E3 Ligases等102个基因的siRNA亚文库。
   Ubiquitin Conjugation Subset 3：包含针对小鼠RING finger和RING finger-like E3 Ligases等330个基因的siRNA亚文库。
3. Opti-MEM (Gibco, catalog number: 31985070)
4. MEM Alpha Medium (Corning, catalog number: 10-022-CV)
5. DPBS (Corning, catalog number: 21-031-CVR)
6. Fetal Bovine Serum (Ausbian, catalog number: VS500T)
7. penicillin streptomycin (Gibco, catalog number: 15140-122)
8. 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco, catalog number: 25200-072)
9. GFP tag Mouse McAb (proteintech, catalog number: 66002-I-Ig)
10. Rabbit Anti-Mouse HRP (Dako Denmark A/S, catalog number: P0260)
11. Nonspecific Ctr Pool (Thermo Fisher, catalog number: D-001206-13-05)
12. RNAiMAX Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: 13778150)
13. DharmaFECT 1 Transfection Reagent (Thermo Fisher, catalog number: T-2001-02)
14. DMSO (Sigma-Aldrich, catalog number: D2650)
15. MG132 (Selleck, catalog number: S2619)
16. Hoechst 33342 (Invitrogen, catalog number: H21492)
17. 16% PFA (Alfa Aesar, catalog number: 30525-89-4)
    

仪器设备

1. 干细胞多色流式细胞分选仪Aria III (BD, BD FACS Aria III)
2. 干细胞多色流式检测仪cytoflex LX (Beckman, CytoFlex LX五激光)
3. 全光谱激发共聚焦显微镜 Leica SP8 WLL (Leica, Leica TCS SP8 WLL)
4. Ensight多功能微孔板检测仪 (PerkinElmer, Ensight)
5. Multidrop自动分液器 (Thermo Fisher, Multidrop Combi)
6. Elx405自动洗板机 (BioTek, ELx405)
7. 台式高速大容量冷冻离心机 (Eppendorf, 5810R)
8. CO₂细胞培养箱 (Thermo Fisher, Series 8000 Direct-Heat CO2 Incubator, 184 L)
9. Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统 (PerkinElmer, Opera LX488/561/640)
   

实验步骤

一、构建C3H10-RANKL-GFP单克隆细胞株

1. 构建phage-RANKL-GFP融合表达质粒。
2. 包装RANKL-GFP慢病毒，辅助质粒为VSVG，Δ8.9。
3. 慢病毒感染C3H10细胞，48 h后流式分选GFP阳性的细胞至96孔板中，1 cell/孔，扩增后western blot / FACS / confocal鉴定RANKL-GFP的表达情况 (如图2所示)，选择正确的单克隆株C3H10-RANKL-GFP-7扩增并冻存。
   
   
   图2. C3H10-RANKL-GFP单克隆细胞株
   
   

二、筛选预实验

对筛选用的细胞密度，转染试剂类型，转染试剂用量等在384孔板中进行了预实验 (设计如图3所示)。转染72 h后用Ensight多功能微孔板检测仪进行检测，明场拍摄细胞形态与密度，488 nm荧光检测GFP。
经转染优化实验，确定最适转染条件为：在384孔板中，使用Lipofectamine^TM DharmaFECT1 0.1 μl/孔，细胞接种密度 1,000个/孔，以MG132 (终浓度10 μM) 作为阳性对照，每个siRNA文库做2个重复。


图3. 筛选预实验384孔板设计图

三、筛选正式实验

1. 阴性对照siRNA的制备：
   使用1x siRNA buffer 稀释Non-targeting siRNA至0.1 μM；将阴性对照siRNA按照如图4所示加入对应孔内，每孔10 μl。
   
   
   图4. 筛选正式实验384孔板设计图
   
   
2. 转染试剂的制备：
   2.1

   用Opti-MEM按照体积比1:100稀释Lipofectamine^TM DharmaFECT1。
   2.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述转染试剂溶液加入siRNA板内 (第2列至第23列)，10 μl/孔。
   2.3

   水平离心机800 × g离心1 min，将siRNA与DharmaFECT1混匀，室温静置20 min。
3. 细胞悬液的制备：
   3.1

   将C3H10-RANKL-GFP-7单克隆细胞株配制成浓度为1,000个细胞/30 μl α-MEM完全培养基的悬液。
   3.2

   使用自动化分液仪 Multidrop Combi将上述细胞悬液加入siRNA板 (第2列至第23列)，30 μl/孔。
   3.3

   为减少边缘效应，在384孔板第1列及第24列加入50 μl α-MEM。
   3.4

   将加好转染试剂和细胞的384板经水平离心机中800 × g离心1 min，放置于CO₂培养箱中培养。
4. 收取细胞进行检测：
   4.1

   在培养48 h后，加入阳性对照MG132 (终浓度10 μM)，继续培养24 h后，取出细胞。
   4.2

   将 Hoechst 33342以1:1000的稀释比例加入384孔板中，在37 °C CO₂培养箱中孵育10 min，染细胞核。
   4.3

   加入终浓度4% PFA，室温孵育10 min，固定细胞。
   4.4

   用Elx405自动洗板机洗板5次，每次加入50 μl PBS，甩干。
   4.5

   使用Opera激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统进行拍照，使用20x水镜及488 nm、405 nm通道，每个孔随机选取5个视野进行拍照。

结果与分析

1. 拍照得到多张如图5所示的384孔板照片。
   
   
   图5. 筛选正式实验384孔板图像之一
   
   
2. 两个重复的384孔板拟合度较好，实验结果可信度较高 (如图6)。
   
   
   图6. 筛选正式实验384孔板两个重复的拟合度
   
   
3. 对细胞质中的GFP荧光强度进行统计分析 (如图7)，找出GFP荧光强度高于阳性对照的孔，对照文库信息找到相应的E3 ligase，构建表达质粒，进行下一步验证 (泛素化降解、相互作用、功能调控等)。
   
   
   图7. 筛选正式实验384孔板绿色荧光强度统计分析
   
   

溶液配方

1. α-MEM完全培养基
   MEM Alpha基础培养基 + 10%胎牛血清 + 1%双抗
   

致谢

邹卫国实验室的该工作得到了中国科学院大学，生物化学与细胞生物学研究所，化学生物学技术平台的大力支持。

参考文献

1. Dikic, I., Wakatsuki, S. and Walters, K. J. (2009). Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nat Rev Mol Cell Biol 10(10): 659-671.
2. Han, Y., You, X., Xing, W., Zhang, Z. and Zou, W. (2018). Paracrine and endocrine actions of bone-the functions of secretory proteins from osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts. Bone Res 6: 16.
3. Koldkjaer Solling, A. S., Harslof, T., Kaal, A., Rejnmark, L. and Langdahl, B. (2016). Hypercalcemia after discontinuation of long-term denosumab treatment. Osteoporos Int 27(7): 2383-2386.