High Throughput Chemical Screens Using Zebrafish Embryos

材料与试剂

1. CellCarrier-96 孔板(PerkinElmer, catalog number: 6055302)，常温保存
2. Pronase (Roche, catalog number: 11459643001)，4 °C保存
3. Tricaine (Sigma, catalog number: A5040)，常温保存
4. 亚甲基蓝 (Sigma, catalog number: 1592700010)，常温保存
5. FDA-approved Drug Library (Selleck, catalog number: L1300)，-80 °C保存
6. Pronase (500 mg/ml) (见溶液配方)
7. 0.2%亚甲基蓝溶液 (见溶液配方)
8. E3培养基 (见溶液配方)
9. Tricaine (4mg/ml) (见溶液配方)
   

仪器设备

1. 移液枪
2. 生化培养箱 (Haier, model: HRSP-生化培养箱)
3. 自动化液体工作站 (含微孔板振荡器) (PerkinElmer, model: JANUS液体工作站)
4. 高内涵图像分析仪 (PerkinElmer, model: Opera Phenix)及配套分析软件Harmony4.1
   

实验步骤

1. 收集受精后48h斑马鱼胚胎，Pronase (2mg/ml)处理5min，去掉胚胎绒毛膜(或人工使用镊子去掉绒毛膜)；
2. 将胚胎移入CellCarrier-96孔板中，每孔5枚胚胎，加入200 μl E3培养基；
3. 通过液体工作站将待筛化合物加入上述96孔板中，微孔板振荡器震荡1 min，充分混匀；
4. 胚胎放置28.5 °C培养箱中孵育24 h；
5. 每孔加入2 μl Tricaine麻醉胚胎，微孔板振荡器震荡1 min；
6. Opera Phenix高内涵图像分析仪进行扫描拍照，每孔一个视野，设置见表1：
   
   表1 Opera Phenix高内涵图像分析仪器参数设置
   
   
   
7. 建立分析序列，计算荧光点数，面积，强度等。
   7.1

   选定分析区域：以EGFP通道为背景，采用“common threshold”方法，将整个视野图片作为分析区域；
   7.2

   选定荧光点：以EGFP通道为背景，选择“Method A”圈定分析区域中的荧光点(也可根据具体情况选择其他方法)，并调整二级参数使选定的荧光点最符合实际情况；
   7.3

   计算上述分析区域中荧光点的强度均值；
   7.4

   设置输出结果，包括荧光点数，荧光点平均强度及面积；
   7.5

   在“Evaluation”中选择全部孔，计算所有孔的结果。

结果与分析

使用Opera Phenix机器完成每块96孔板扫描仅需3-5 min，大大缩短了筛选时间。并且，扫描结果通过Harmony4.1软件分析，能较真实反应实际情况。如图1所示，软件能够计算每孔胚胎中EGFP+细胞数量，荧光强度等参数，为化合物的作用效果提供参考。


图1. Opera Phenix机器扫描结果

注意事项

1. 实验操作过程中，勿触碰CellCarrier-96孔板底部，否则会干扰Opera Phenix机器扫描结果；
2. 在Opera Phenix机器扫描之前应充分麻醉胚胎，避免在扫描过程中因胚胎游动而造成实验误差。
   

溶液配方

1. Pronase (500 mg/ml): 称取25 g Pronase溶解于50 ml去离子水，并分装到1.5 ml离心管中，-20 °C保存。
2. 0.2%亚甲基蓝溶液：称取0.1 g亚甲基蓝粉末溶解于50 ml去离子水。
3. E3培养基：称取1.2 g海盐溶解于20 L去离子水，并加入2.5 ml的0.2%亚甲基蓝溶液。
4. Tricaine (4mg/ml)：称取2 g Tricaine溶解于100 ml去离子水，加入10 ml Tris-HCl(pH 9.5)，再次加入去离子水至500 ml。
   

致谢

感谢国家自然科学基金(31371479)和广慈卓越青年培养计划对本工作的支持。

参考文献

1. Burn, G.L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D.F., Zychlinsky, A.(2021). The Neutrophil. Immunity 54(7):1377-1391.
2. Haffter, P., Granato, M., Brand, M., Mullins, MC., Hammerschmidt, M., Kane, D.A., Odenthal, J., van Eeden, F.J., Jiang, Y.J., Heisenberg, C.P., Kelsh, R.N., Furutani-Seiki, M., Vogelsang, E., Beuchle, D., Schach, U., Fabian, C., Nüsslein-Volhard, C.(1996). The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36.
3. Howe, K., Clark, M., Torroja, C.et al. (2013) .The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature 496, 498–503.
4. MacRae, C.A., Peterson, R.T. (2015). Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov14(10):721-731.
5. Rennekamp, A.J., Peterson, R.T. (2015).15 years of zebrafish chemical screening. Curr Opin Chem Biol 24:58-70.